胡京昂 ，劉雪霞 ，蔡雨惠 ，曹剛強(qiáng) ，應(yīng)芳卿

番茄黃化曲葉病 （Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是威脅番茄生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害，發(fā)病的植株葉片邊緣呈鮮黃色、卷曲，葉脈褪綠，葉肉變厚，葉片變小，嚴(yán)重時(shí)植株矮化萎縮，一旦發(fā)生，番茄產(chǎn)量會(huì)受到很大的損失，嚴(yán)重時(shí)造成絕產(chǎn)。近幾年該病在中國(guó)自南向北迅速傳播蔓延，廣東、江蘇、安徽、山東、河北、河南、浙江、上海、北京、臺(tái)灣等地均已有報(bào)道[1~9]。在國(guó)內(nèi)大部分省市該病是由雙生病毒科 （Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begamovirus） 番茄黃化曲葉病毒 （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染引起。

TYLCV寄主主要是番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆和煙草等，傳毒介體為煙粉虱，同時(shí)可經(jīng)嫁接傳播，但不能經(jīng)機(jī)械摩擦和種子傳毒[10]。番茄黃化曲葉病毒病已經(jīng)成為為害世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的毀滅性病害，已給熱帶和亞熱帶地區(qū)很多國(guó)家的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

2007年在黃河以南的扶溝縣夏秋茬番茄和開封縣、中牟縣越冬溫室番茄地里均發(fā)現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀，且煙粉虱發(fā)生嚴(yán)重；2008年在黃河以北的內(nèi)黃縣也發(fā)生類似的癥狀；自2009年以來(lái)，除新野縣以外，河南各番茄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，主產(chǎn)區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重。為了明確引起河南省番茄黃化癥狀的病毒種類及其起源變異，2011年秋季我們?cè)诓^(qū)采集病樣，并對(duì)其部分基因組進(jìn)行了克隆和分析，結(jié)果表明，引起河南省番茄黃化曲葉癥狀的病原為番茄黃化曲葉病毒，這是該病毒病在河南地區(qū)發(fā)生的首次分子檢測(cè)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病樣采集：2011年秋季在周口地區(qū)采集具有黃化曲葉病毒病典型癥狀，植株矮化、葉片卷曲、葉色褪綠、葉片增厚、具黃化癥狀的番茄葉片，-80℃保存?zhèn)溆?，編?hào)為HN-ZK。

菌株與載體：大腸桿菌DH5a、pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。

1.2 葉片總DNA提取

利用CTAB法提取番茄葉片總DNA，取0.1 g番茄葉片樣品，液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入600μL 65℃ 預(yù)熱的3%CTAB抽提緩沖液 （3%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NaCl，40 mmol/L EDTA，0.2%巰基乙醇)， 混勻后于65℃ 溫育 30 min，再用 600 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）抽提兩次后，上清液中加入等體積的異丙醇，經(jīng)異丙醇沉淀后，取沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌，干燥后溶于TE中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆和序列分析

根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 PA/PB[11]。 PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′（K=G 或 T；W=A 或 T；V=A，C 或G；S=C 或 G；Y=C 或 T；R=A 或 G；B=C，T 或 G），擴(kuò)增雙生病毒基因間隔區(qū)和部分外殼蛋白基因約500 bp的特異片段，并進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，上述引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液 2.5μL，dNTPs 1.0 μL （2.5 mmol/L），PA/PB 引物各 1.0 μL（100 ng/μL），Taq 酶 0.2 μL （5 U/μL）， 模板 DNA 1.0μL，加ddH2O至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，按下列條件進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)（94℃變性 45 s，50℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物，加入loading buffer和Gene Finder后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在可見(jiàn)光透視儀上顯示電泳結(jié)果。經(jīng)杭州博日科技有限公司的膠回收試劑盒純化約500 bp PCR產(chǎn)物，把純化后的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進(jìn)行處理和分析，根據(jù)相似性明確病毒種類，進(jìn)化樹構(gòu)建采用Mega 4.0的臨近相鄰法 （Neighbor-joining）。序列比對(duì)和進(jìn)化分析中所用病毒（分離物）有：番茄黃化曲葉病毒廊坊分離物 （TYLCV-Langfang；JF833036），番茄黃化曲葉病毒浙江分離物 （TYLCV-ZJHZ12；FN256256），中國(guó)番茄黃化曲葉病毒四川分離物（TYLCV-SC65A-3；GU199588），中國(guó)番茄黃化曲葉病毒廣西分離物 （TYLCV-CHI；AF311734），廣東番茄黃化曲葉病毒廣東分離物（TYLCGDV-G3；AY602166），番茄黃化曲葉病毒安徽分離物（TYLCV-AH-HB1；FN650807），番茄黃化曲葉病毒江蘇分離物 （TYLCV-JSNJ1；FN256259），番茄黃化曲葉病毒北京分離物 （TYLCV-Beijing3；GU983859），番茄黃化曲葉病毒上海分離物（TYLCV-sh10；EU031444）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

以提取的番茄葉片DNA為模板，用通用引物PA/PB進(jìn)行PCR檢測(cè)，從HN-ZK樣品中擴(kuò)增出約500 bp的特異性條帶（圖1），結(jié)果表明，河南周口種植的番茄被煙粉虱傳播的雙生病毒侵染。

2.2 序列分析

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果M：DL1000 DNA Marker；1：HN-ZK 樣品

圖2 雙生病毒基因組DNA-A部分片段核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

將PCR得到的500 bp左右的條帶回收并克隆測(cè)序，序列全長(zhǎng)為539 bp，序列的GenBank登錄號(hào)為JQ754307。獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進(jìn)行處理和分析，該序列與番茄黃化曲葉病毒分離物AH-HB1的序列相似性高達(dá)98.7%，與其他番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在97%以上，而與中國(guó)番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在75%以下，這表明樣品HN-ZK已被番茄黃化曲葉病毒感染而導(dǎo)致番茄黃化曲葉病的發(fā)生。將樣品雙生病毒基因組DNA-A部分片段與其他9個(gè)具有代表性的雙生病毒分離物核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹（圖2），結(jié)果顯示，廣東番茄黃化曲葉病毒、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒和番茄黃化曲葉病毒分別在3個(gè)不同的分支，其中河南分離物與來(lái)源于安徽、上海、浙江、江蘇、河北廊坊和北京的番茄黃化曲葉病毒分離物單獨(dú)聚為一個(gè)小分支，河南分離物與安徽分離物親緣關(guān)系相對(duì)較近。

3 結(jié)論與討論

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南省各地相繼暴發(fā)，特別是秋延后番茄，給我省的番茄生產(chǎn)造成了巨大的損害。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)了河南周口番茄黃化曲葉病的病原，通過(guò)PCR、克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)，侵染周口番茄的雙生病毒為番茄黃化曲葉病毒。鑒于該病在我國(guó)的傳播基本呈現(xiàn)自南向北、自東向西的蔓延趨勢(shì)，以及序列對(duì)比表明，河南分離物與安徽分離物序列相似性最高達(dá)到98.7%，從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也可以看出，河南分離物與安徽分離物的親緣關(guān)系最近，推測(cè)河南番茄黃化曲葉病毒可能來(lái)源于安徽。

雙生病毒種類繁多，在上海、浙江、江蘇、安徽和北京等省市多為番茄黃化曲葉病毒侵染引起，河南的番茄黃化曲葉病已經(jīng)初步鑒定為番茄黃化曲葉病毒侵染，但本研究?jī)H克隆測(cè)序了一個(gè)地區(qū)的病害樣本，下一步將在河南各地采集病害樣本，進(jìn)行全面的檢測(cè)和鑒定，徹底明確河南省內(nèi)為害番茄的雙生病毒種類和分布。

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