王斌，袁甜，張譯文，王志遠(yuǎn)，秦英玲，薛仙子，常亞青

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410013)

仿刺參Apostichopus japonicus是北方沿海主要養(yǎng)殖種類之一，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前發(fā)現(xiàn)的仿刺參多糖主要分為兩類:一類是糖胺聚糖，即黏多糖［1］;另一類是巖藻多糖，是由L－巖藻糖構(gòu)成的直鏈多糖［2］。刺參多糖具有保護(hù)神經(jīng)組織［3］、抑制細(xì)菌感染及降血脂等方面的作用［4］。有關(guān)刺參多糖抗腫瘤方面的研究也有一些報(bào)道，胡仁杰等［5］研究了刺參酸性黏多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，刺參酸性黏多糖能抑制小鼠S180肉瘤和乳腺癌細(xì)胞的DNA合成;Kafiya等［6］從刺參中分離得到的兩種巖藻多聚糖硫酸酯能抑制破骨細(xì)胞的形成。本研究中，作者采用堿解、酶解和醇沉淀的方法提取仿刺參腸組織中的多糖類活性物質(zhì)，研究其對(duì)小鼠實(shí)體腫瘤的抑制效果以及對(duì)機(jī)體相關(guān)免疫指標(biāo)的影響，探討了多糖類活性物質(zhì)的作用機(jī)理，旨在深入了解仿刺參機(jī)體組織的生物活性成分以及該活性物質(zhì)的保健和藥用價(jià)值，為仿刺參藥用產(chǎn)品的開發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及移植瘤株 試驗(yàn)用清潔級(jí)昆明種小鼠62只(雄性)，體質(zhì)量為(25±2)g，于2010年8月購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;小鼠H22肝癌瘤株由大連醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室惠贈(zèng);仿刺參腸組織購(gòu)自大連棒棰島海產(chǎn)有限公司。

1.1.2 主要試劑 小鼠白細(xì)胞介素2(IL－2)試劑盒包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、10×標(biāo)本稀釋液、20×濃縮洗滌液和標(biāo)準(zhǔn)品 (底物工作液，第一抗體工作液，終止液);小鼠腫瘤壞死因子(TNF－α)試劑盒包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、10×標(biāo)本稀釋液、20×濃縮洗滌液和標(biāo)準(zhǔn)品(底物工作液，終止液)，兩種試劑盒均購(gòu)自上海西堂生物公司。

1.2 方法

1.2.1 仿刺參腸組織中粗多糖的提取 取一定量仿刺參的腸組織，擠出腸內(nèi)容物，用生理鹽水清洗3次，再用勻漿器勻漿;加入等倍0.46 mol/L的碳酸鉀溶液堿解100 min;再加入等倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.37%的胰蛋白酶 (酶活性為4～6 U/mg)酶解220 min，以3500 r/min離心10 min;加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇 (邊加入邊攪拌)醇沉淀，至沉淀完全析出，以3500 r/min離心10 min;收集沉淀，加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇、丙酮分別混懸，靜置后吸取上清液，置于烘箱 (37℃)中烘干，即得到仿刺參腸組織中的粗多糖 (簡(jiǎn)稱為腸多糖)［1］。稱取一定量的腸多糖干粉，用2倍體積的PBS緩沖液溶解成濃縮液，用濾器 (孔徑為0.22 μm)除菌，置于4℃下保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將吸取的毫升數(shù)換算成含溶質(zhì)的毫克數(shù)計(jì)算給藥劑量。

1.2.2 腫瘤模型的建立及試驗(yàn)分組

1)腹水瘤模型的建立。取小鼠H22肝癌瘤株，調(diào)細(xì)胞濃度為107個(gè)/mL，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒小鼠腹部皮膚，進(jìn)行腹腔接種 (0.2 mL/只)，共接種兩只小鼠。待H22肝癌瘤株在小鼠體內(nèi)復(fù)蘇7～9 d并明顯出現(xiàn)腹水后，在無(wú)菌條件下抽取小鼠腹水0.1 mL，然后用臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算1 mL瘤液中活體瘤細(xì)胞的數(shù)量，達(dá)到60%以上即可用于構(gòu)建腫瘤模型。抽取達(dá)到要求的腹水，用生理鹽水將瘤細(xì)胞稀釋成2×107～6×107個(gè)/mL瘤細(xì)胞懸液，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒小鼠體表，然后將瘤懸液接種于小鼠腹部皮下組織，接種量為0.2 mL/只［7］，接種后的小鼠作為試驗(yàn)用瘤模小鼠。

2)試驗(yàn)分組。將小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只。第1～3組為瘤模小鼠，分別注射劑量為200、100、50 mg/(kg·d)的仿刺參腸多糖，記為腸多糖高、中和低劑量組。第4組為給藥健康對(duì)照組，給健康小鼠腹腔注射腸多糖，劑量為200 mg/(kg·d)。第1～4組為腸多糖組，使用的腸多糖按照上述劑量配制成不同濃度的溶液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，在接種腫瘤細(xì)胞前5 d開始給藥，連續(xù)給藥15 d。第5組為腫瘤對(duì)照組，每天給瘤模小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只。第6組為健康對(duì)照組，每天給健康小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只。

從接種腫瘤細(xì)胞開始，試驗(yàn)共進(jìn)行10 d，觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 各組小鼠停藥后，次日脫頸處死小鼠并稱重，完整剝離瘤組織并拍照，用電子天平進(jìn)行稱重，并計(jì)算抑瘤率:

處死小鼠后完整剝離出胸腺和脾臟，用電子天平稱量脾臟、胸腺的質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾腺指數(shù):

胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

在小鼠處死前摘除眼球，從眼底取血0.5 mL，在室溫下靜置20 min后，以3000 r/min離心30 min，收集上清液，置于冰箱 (－80℃)中冷凍保存，并空運(yùn)至上海西堂生物公司測(cè)定血清中IL－2及TNF－α的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 外觀狀態(tài)及體征

小鼠接種瘤細(xì)胞2 d內(nèi)，外觀無(wú)明顯變化，活動(dòng)、飲食正常;接種3～4 d后，腫瘤對(duì)照組小鼠可觸及到皮下綠豆大小的腫塊，腸多糖劑量組部分小鼠可觸及到皮下米粒大小腫塊;接種6 d后，腫瘤對(duì)照組可觸及到皮下黃豆大小腫塊，腸多糖劑量組可觸及到綠豆大小腫塊，此時(shí)各組成瘤率約為80%。腸多糖高、中、低劑量組腫瘤生長(zhǎng)較腫瘤對(duì)照組緩慢。腫瘤對(duì)照組小鼠從第4天開始飲食減少，皮毛無(wú)光澤，豎毛現(xiàn)象明顯，活動(dòng)明顯減少，第6天和第8天各死亡1只，另外還有2只小鼠出現(xiàn)腹水，未形成實(shí)體瘤;腸多糖高、中、低劑量組小鼠飲食較正常，皮毛有光澤，豎毛現(xiàn)象不明顯，腸多糖中、低劑量組均有一只小鼠出現(xiàn)腹水，未形成實(shí)體瘤。兩個(gè)健康對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)均正常。

2.2 實(shí)體瘤的生長(zhǎng)狀況及小鼠的存活情況

至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腫瘤對(duì)照組有2只小鼠在試驗(yàn)結(jié)束前4 d死亡，腹水明顯，未發(fā)現(xiàn)皮下腫物;兩個(gè)健康對(duì)照組小鼠均健康存活;腸多糖低、中劑量組各有一只小鼠腹水明顯，未見皮下實(shí)體瘤，而腸多糖高劑量組小鼠全部存活，皮下腫瘤體積明顯小于其它腫瘤組 (圖1)。

從表1可見:腸多糖高劑量組小鼠的瘤質(zhì)量與腫瘤對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)，腸多糖中、低劑量組小鼠的瘤質(zhì)量與腫瘤對(duì)照組差異顯著(P＜0.05);腸多糖高、中、低劑量組對(duì)患H22肝癌小鼠實(shí)體瘤的抑瘤率分別為90.1%、85.2%和71.7%。

圖1 腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠腫瘤的抑制作用Fig.1 Antineoplastic effect of the intestinal polysaccharides on H22－bearing mice

表1 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響(±s)Tab.1 Inhibitory effects of the intestinal polysaccharides on growth of H22－bearing mice

表1 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響(±s)Tab.1 Inhibitory effects of the intestinal polysaccharides on growth of H22－bearing mice

注:*表示與腫瘤對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05);＊＊表示與腫瘤對(duì)照組差異極顯著 (P＜0.01)，下同。Note:*means significant difference compared with the tumor control group(P＜0.05);＊＊means very significant difference compared with the tumor control group(P＜0.01)，et sequentia.

組別group 劑量dose/(mg·kg－1·d－1) 瘤質(zhì)量tumor weight/g 抑瘤率inhibitory rate/%腫瘤對(duì)照組tumor contorl group 1.66±1.44腸多糖高劑量組 high－dose polysaccharide 200 0.165±0.07＊＊ 90.1腸多糖中劑量組middle－dose polysaccharide 100 0.245±0.05* 85.2腸多糖低劑量組low－dose polysaccharide 50 0.470±0.20* 71.7

2.3 腸多糖對(duì)H22肝癌實(shí)體瘤小鼠免疫指標(biāo)的影響

2.3.1 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù) 從表2可見:各腸多糖組小鼠的脾臟指數(shù)與腫瘤對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但隨著腸多糖劑量的上升脾臟指數(shù)也上升;各腸多糖組小鼠的胸腺指數(shù)均高于腫瘤對(duì)照組，除腸多糖低劑量組外其余各組均與腫瘤對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)。

表2 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠脾腺指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effects of the intestinal polysaccharides on thymus index and spleen index of H22－bearing mice

表2 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠脾腺指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s)Tab.2 Effects of the intestinal polysaccharides on thymus index and spleen index of H22－bearing mice

組別group 劑量dose/(mg·kg－1·d－1) 脾臟指數(shù)spleen index 胸腺指數(shù)thymus index腫瘤對(duì)照組tumor contorl group 5.00±1.69 2.05±0.86給藥健康對(duì)照組polysaccharide control group 200 6.20±1.03 3.00±0.59*腸多糖高劑量組 high－dose polysaccharide 200 5.88±1.76 2.70±0.39*腸多糖中劑量組 middle－dose polysaccharide 100 5.27±1.18 2.58±0.79*腸多糖低劑量組 low－dose polysaccharide 50 4.75±0.89 2.07±0.62

2.3.2 白細(xì)胞介素2(IL－2)和腫瘤壞死因子(TNF－α) 從表3可見:腸多糖高劑量組小鼠血清中的IL－2含量最高 (92.521 pg/mL)，與3個(gè)對(duì)照組及其它兩個(gè)腸多糖劑量組均有極顯著差異(P＜0.01)，而腸多糖中、低劑量組與健康對(duì)照組差異極顯著 (P＜0.01)，與腫瘤對(duì)照組、給藥健康對(duì)照組均無(wú)顯著差異 (P＞0.05);腸多糖高劑量組小鼠血清中的TNF－α含量低于腸多糖中、低劑量組，健康對(duì)照組的TNF－α含量最低，其次為給藥健康對(duì)照組，腸多糖高、中、低劑量組與3個(gè)對(duì)照組均無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。

表3 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠血清中白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子含量的影響(±s)Tab.3 Effects of the intestinal polysaccharide on IL－2 and TNF－α in H22－bearing mice

表3 仿刺參腸多糖對(duì)患H22肝癌小鼠血清中白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子含量的影響(±s)Tab.3 Effects of the intestinal polysaccharide on IL－2 and TNF－α in H22－bearing mice

注:同列中標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著 (P＜0.01)，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著 (P＜0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著 (P＞0.05)。Note:The means with different capital letters within the same column are very significantly different at the 0.01 probability level，with different letters being significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letters within the same column are not significant differences.

組別 group 劑量/(mg·kg－1·d－1)dose白細(xì)胞介素2/(pg·mL－1)IL－2腫瘤壞死因子/(pg·mL－1)TNF－α健康對(duì)照組normal contorl group 15.48±2.82cC 21.44±7.24腫瘤對(duì)照組tumor contorl group 41.76±1.16bB 38.34±16.21給藥健康對(duì)照組polysaccharide control group 200 36.407±0.00bB 26.74±0.59腸多糖高劑量組 high－dose polysaccharide 200 92.521±10.08aA 30.891±4.22腸多糖中劑量組 middle－dose polysaccharide 100 36.408±4.01bB 37.47±12.37腸多糖低劑量組 low－dose polysaccharide 50 33.741±0.29bB 36.07±6.19

3 討論

本研究結(jié)果表明，仿刺參腸多糖對(duì)H22小鼠實(shí)體瘤具有明顯的抑制效果，抑瘤率最高達(dá)到90.1%，抑瘤率與給藥劑量呈正相關(guān)。周湘盈等［8］的研究結(jié)果表明，海參的整體凍干粉對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率為34.8%;蘇秀榕等［2］報(bào)道，仿刺參多糖對(duì)肝癌腹水型腫瘤細(xì)胞Hca－f的純系BALB－C小鼠的抑瘤率為73.56%;胡仁杰等［5］報(bào)道，從仿刺參體壁中提取的酸性黏多糖對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤率為55%。而本研究中使用的仿刺參腸多糖對(duì)H22小鼠實(shí)體瘤的抑瘤率遠(yuǎn)高于上述研究結(jié)果。關(guān)于仿刺參組織活性物質(zhì)對(duì)腫瘤抑制作用的研究均是以刺參體壁組織為試驗(yàn)材料［2－7］，而且日常生活中人們所食用的也是仿刺參的體壁，因此對(duì)仿刺參腸組織中多糖的研究報(bào)道極少。本研究中，作者首次將從仿刺參腸組織中提取的粗多糖作用于H22肝癌實(shí)體瘤模型小鼠，測(cè)定其對(duì)腫瘤的抑制率，結(jié)果表明，仿刺參腸組織中的粗多糖對(duì)腫瘤的抑制效果明顯高于體壁組織。該研究結(jié)果可為刺參組織的綜合利用提供新的思路，有關(guān)仿刺參腸多糖的主要成分將是今后研究的重點(diǎn)。

目前普遍認(rèn)為，多糖的抗瘤機(jī)制主要是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)腫瘤的防御機(jī)制，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的［9－11］。多糖進(jìn)入機(jī)體后可上調(diào)多種免疫指標(biāo)，如免疫器官的臟器指數(shù)及各種細(xì)胞因子等。為了探索仿刺參腸多糖對(duì)腫瘤的抑制機(jī)理，本研究中測(cè)定了用腸多糖治療H22肝癌實(shí)體瘤模型小鼠后的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，結(jié)果顯示，注射腸多糖的3組小鼠，隨著腸多糖劑量的增加其脾臟、胸腺指數(shù)均有所增加，但僅腸多糖高、中劑量組小鼠的胸腺指數(shù)與腫瘤對(duì)照組相比差異顯著 (P＜0.05)。該結(jié)果與王靜鳳等［12］報(bào)道的日本刺參對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的影響相同。給小鼠注射仿刺參腸多糖后，其胸腺指數(shù)的變化提示機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫上調(diào)，同時(shí)脾臟指數(shù)也有上升趨勢(shì)。因此，可以認(rèn)為，仿刺參腸多糖對(duì)提高機(jī)體抗腫瘤免疫起到了積極作用。

IL－2是一種主要由輔助性T淋巴細(xì)胞分泌的淋巴因子，它能激活小鼠的自然殺傷細(xì)胞使之成為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞 (LAK)，LAK具有廣譜的殺傷腫瘤活性。IL－2還可激活多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在免疫調(diào)節(jié)中具有極為重要的作用［13］。據(jù)報(bào)道，從日本瓜參 Cucumaria japonica中提取出來(lái)的海參皂甙 (cumaside)能激活淋巴細(xì)胞的吞噬活性以及產(chǎn)生IL－6和TNF－α，從而顯著提高機(jī)體的免疫功能［14］;海參多糖能明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IL－2，顯著地增強(qiáng)小鼠的免疫功能［15］;海膽黃多糖能提高小鼠自然殺傷細(xì)胞的活力，刺激其分泌IL－1和IL－2，并增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞自身的活性，輔助細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)［16］。本研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，即小鼠血清中的IL－2含量隨腸多糖劑量的增加而升高，且腸多糖高劑量組小鼠血清中IL－2的含量高達(dá)92.521 pg/mL，與腫瘤對(duì)照組、給藥健康對(duì)照組和健康對(duì)照組均有極顯著差異 (P＜0.01)。IL－2是小鼠體內(nèi)主要抗腫瘤的相關(guān)細(xì)胞因子，IL－2含量的升高進(jìn)一步證實(shí)了仿刺參腸組織中多糖活性物質(zhì)的抗腫瘤活性與提高細(xì)胞免疫水平密切相關(guān)。腸多糖高、中、低劑量組小鼠血清中TNF－α的含量均低于腫瘤對(duì)照組，但隨著腸多糖劑量的升高，小鼠血清中的TNF－α含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，具體原因暫不十分清楚。鑒于細(xì)胞因子的產(chǎn)生受多種因素干擾，因此不能簡(jiǎn)單的對(duì)其進(jìn)行分析，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)并對(duì)其它相關(guān)因素檢測(cè)后，再進(jìn)行綜合分析。由于測(cè)定的免疫指標(biāo)不夠全面，不能詳盡的討論仿刺參腸多糖對(duì)H22肝癌實(shí)體瘤模型小鼠的抑瘤機(jī)制。但可以確定，仿刺參腸多糖具有顯著的抗腫瘤活性，是今后開發(fā)抗腫瘤保健品和藥物的良好材料。

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