馬濤 肖品 聶磊

(青海大學醫(yī)學院藥學系，青海西寧810001)

藏藥“葉蒙”，為毛茛科鐵線蓮屬植物，其花白色的在青藏高原上只有短尾鐵線蓮Clematis brevicaudata DC.比較符合藏文獻的描述〔1〕，《宇妥本草》中“斂黃水”的功效與現(xiàn)代醫(yī)學的抗炎、鎮(zhèn)痛相一致。本著開發(fā)藏藥的目的，本文用抗炎鎮(zhèn)痛的藥效學方法進行實驗研究同時確定其有效部位，收到滿意的效果，現(xiàn)報道如下。

1 薄層色譜

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備:對照藥材與實驗用藥材分別粉碎(過80目篩)、用石油醚脫脂，濾渣用95%乙醇加熱回流3次，合并后趁熱過濾，濾液減壓回收乙醇，濾渣用少量乙醇溶解，作為薄層色譜分析的點樣溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備:取齊墩果酸的對照品加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 對照藥材品溶液的制備:取短尾鐵線蓮的對照藥材加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照藥材溶液。

1.2.4 薄層層析條件選擇:硅膠G板(青島海洋化工分廠，規(guī)格50×100);展開劑:三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)的上層溶液，三氯甲烷－丙酮－乙酸(12:3:0.7)的上層溶液;顯色劑:10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰〔2〕。

1.2.5 操作:硅膠G板:從左到右點樣，用相應(yīng)的展開劑分別展開，顯色劑顯色。

注:左圖中，從左往右點樣依次是齊墩果酸對照溶液、齊墩果酸粗提物溶液、短尾鐵線蓮的對照藥材溶液、實驗用藥材溶液;右圖中，從左往右點樣依次是齊墩果酸對照溶液、齊墩果酸粗提物溶液。黑色斑點表示齊墩果酸。

1.3 實驗結(jié)果

用三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)展開劑展開的齊墩果酸對照品、藥材對照品、供試品和齊墩果酸粗提品，斑點清晰，無拖尾現(xiàn)象，在紫外燈(365nm)下，對照藥材斑點、供試品斑點、粗提品斑點在與對照品斑點相同的位置上，并顯出紫藍色，其Rf均為0.54。初步鑒定結(jié)果是:短尾鐵線蓮中含有齊墩果酸。

②嚴格執(zhí)行醫(yī)院相關(guān)規(guī)定,且定期對護理人員進行培訓,繼而讓其完全掌握無菌操作理念,且進一步增強技能水平,養(yǎng)成嚴謹?shù)膽B(tài)度、高度的責任心,繼而起到避免醫(yī)院感染事件的發(fā)生。

2 抗炎實驗

2.1 儀器、試劑與動物

2.1.1 儀器:RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);SHZ－III型循環(huán)水真空泵 (上海亞榮生化儀器廠);DL－360E智能超聲波清洗器 (上海之信儀器有限公司);HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);TD電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司);一次性無菌注射器(1mL)(江西金山醫(yī)療器械有限責任公司);一次性無菌注射器(10mL)(陜西省華秦醫(yī)療器械廠)。

2.1.2 試劑與動物:短尾鐵線蓮醇溶物混懸液、齊墩果酸粗提物混懸液(由青海大學醫(yī)學院中藥實驗室制作提供)、新鮮雞蛋1個、生理鹽水、乙酰水楊酸(吉林省三精醫(yī)藥有限責任公司，批準文號:國藥準字H22022732);無水乙醇、三氯甲烷、吐溫80、濃鹽酸均為分析純;SD大鼠(由青海省地方病防治所提供，動物證號:青醫(yī)動管:001號)

2.2 實驗用短尾鐵線蓮成分提取:以95%乙醇為溶劑供試液的制備工藝 稱取短尾鐵線蓮400.00g用3924mL95%乙醇超聲提取2h，過濾得到乙醇提取液，對藥渣進行二次超聲提取，將所得乙醇提取液與前者混合，于60℃水浴鍋加熱一個夜晚，得到烯醇提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃回流，回收乙醇，得浸膏。用三氯甲烷:乙醇=14:6的混合液作為萃取劑，對浸膏進行萃取，得到乙醇提取液、三氯甲烷提取液和殘渣(舍棄)。對三氯甲烷提取液在微熱條件下邊攪拌邊加熱至45℃，靜置一個夜晚，加蒸餾水至1:1，加熱蒸發(fā)除去三氯甲烷，與齊墩果酸粗提物分別用95%乙醇溶解，再加熱蒸發(fā)，留出部分樣品備用，將剩余部分加蒸餾水至1:1，加1mL“吐溫80”制得混懸液。

2.3 致炎劑制備:將新鮮雞蛋清與蒸餾水按1:9混合制得致炎劑。

2.4 動物分組及給藥:取40只SD大鼠隨機分為A、B、C、D、E5組，分別為陰性對照組、乙酰水楊酸陽性對照組、齊墩果酸粗提取物溶液液LD50的1/3給藥量組、乙醇提取液LD50的1/5給藥量組、乙醇提取液LD50的1/3給藥量組。對每組大鼠編號、稱重、測量右后腳踝周長、計算給藥量。在給藥1/2h后，對每只大鼠注射致炎劑。此后，每間隔15min測量同一部位的周長〔3〕。

2.5 實驗數(shù)據(jù):實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 SD大鼠右后腳踝周長變化數(shù)值(cm)

2.5 實驗結(jié)果:由數(shù)據(jù)可知，短尾鐵線蓮乙醇提取液對抗腳踝腫脹效果強于復方乙酰水楊酸的抗炎作用，同時也比齊墩果酸的抗炎效果好;同一部位提取液不同的給藥劑量在抗炎效果中也起不同作用。

3 高效液相法

3.1 儀器與材料:高效液相色譜儀(日本島津)，LC－10AT泵，ZA－100進樣器，N2000工作站，SPD－10A檢測器，SY1200T超聲波清洗器，ZF－1型三用紫外分析儀。齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110773－200811)，試劑除乙腈為色譜純外，其他均為分析純，水為重蒸餾水。

3.2 方法

3.2.1 色譜條件:色譜柱:HYPERSIL(C18200mmx4.6mm，5μm)，流動相:乙腈 －0.5% 冰乙酸(85:20)，流速:0.8mL，檢測波長210nm，溫度:室溫。

3.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取齊墩果酸對照品10.08mg，加甲醇定容至50mL，精密吸取5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液作為對照品溶液。

3.2.3 齊墩果酸粗提物溶液的制備:取齊墩果酸粗提物，加甲醇定容至50mL，精密吸取5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液齊墩果酸粗提物作為溶液。

3.2.4 供試品溶液的制備:取原藥短尾鐵線蓮，研細，精密稱取，置小燒杯中，加入適量甲醇超聲提取30min，過濾，置25mL容量瓶中，定容后搖勻，作為供試品溶液〔4〕。

3.2.5 標準曲線的繪制:精密吸取齊墩果酸對照品溶液2、4、10、16、20μL 依次進樣，測定峰面積，以進樣量為橫坐標(X)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得回歸線方程:y=227323.17x－193813.14，相關(guān)系數(shù) r=0.9978。表明齊墩果酸在0.2～2.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 結(jié)果:經(jīng)結(jié)果對比可知:供試品與齊墩果酸對照品在相同時間點出峰，說明可以采用高效液相色譜法鑒別出短尾鐵線蓮中齊墩果酸的存在。

4 討論

短尾鐵線蓮是獨具高原特色的常用藏藥之一。藏醫(yī)認為短尾鐵線蓮有“提升胃溫;破穿腫瘤，托膿”的作用。《形態(tài)比喻》記載說，“鐵線蓮為治寒性腫瘤良藥，味辛、微甘，功效提升胃溫，治腫瘤，引黃水?！敝嗅t(yī)稱該屬黃花鐵線蓮為鐵線透骨草，具有祛風濕、止痹痛的功能，鐵線蓮屬藥物威靈仙具有祛風除濕，通絡(luò)止痛，消痰水，散癖積的作用。威靈仙所含成分與短尾鐵線蓮相同，應(yīng)與短尾鐵線蓮具有相同作用。相關(guān)文獻報道證明，木犀科植物齊墩果的葉、女貞果實、龍膽科植物青葉膽全草、傘形科植物大星芹的葉、根中含有相對豐富的齊墩果酸，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用〔5〕。本實驗表明，短尾鐵線蓮中主要成分是齊墩果酸，實驗結(jié)果表明，在對抗SD大鼠足腫脹試驗中，P＜0.01，具有統(tǒng)計學差異，這與藏醫(yī)學中相關(guān)醫(yī)學的文獻記錄相一致。作為毛茛科的藥用植物，短尾鐵線蓮分布廣泛、儲存量大，是獨具高原特色的藏藥之一，具有良好的開發(fā)利用價值。

〔1〕中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志〔M〕.西寧:青海人民出版社，1991.248.

〔2〕羅海燕，余蔥蔥，毛羽.薄層掃描法測定亮舒片中齊墩果酸的含量〔A〕.海口:中國熱帶醫(yī)學，2007，07(3):1087～1089.

〔3〕吳論，梅全喜，鐘希文，等.濃薄荷水對雞蛋清致大鼠足趾腫脹影響的實驗研究〔R〕.當代醫(yī)學，2010，21(2):2.

〔4〕李夢.HPLC法測定女貞子中齊墩果酸的含量〔A〕.合肥:安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，10525～10526.

〔5〕中國醫(yī)學科學院藥物研究所.中藥志(第一冊)〔M〕.人民衛(wèi)生出版社，1979.201.

〔6〕戴岳等.齊墩果酸的抗炎作用〔J〕.北京:中國藥理學與毒理學雜志，1989，3(2):96.