王 俊， 徐倩倩， 黃 超， 張 柯， 徐葉葉， 魯 丹， 黃毅萍

（安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230039）

0 引言

有機(jī)高分子與無(wú)機(jī)磁性納米粒子的復(fù)合材料已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，隨著其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離技術(shù)［1］、DNA與藥物載體等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［2］。

絲素蛋白是一種天然高分子纖維蛋白質(zhì)，以其優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、耐熱絕緣和光澤鮮亮等特性被譽(yù)為“纖維皇后”。更因其良好的生物相容性、可降解性、優(yōu)良的透氧、透水性能，從紡織品到生物醫(yī)藥，已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用［3－4］。目前絲素蛋白的研究領(lǐng)域包括人工韌帶和血管、軟骨和骨組織工程及絲素蛋白神經(jīng)組織工程。根據(jù)六氟異丙醇與絲蛋白復(fù)合產(chǎn)物在小鼠身體組織的免疫研究，以及鼠細(xì)胞L2929在絲素蛋白膜上生長(zhǎng)情況表明，絲素蛋白和膠原蛋白一樣，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)，生物相容性能良好［5］。有研究采用蠶絲與軟骨細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，探索了蠶絲作為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)支架的可行性，發(fā)現(xiàn)蠶絲對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的吸附作用，并能維持軟骨細(xì)胞正常形態(tài)和功能，是適合軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)的良好的天然支架。而絲素蛋白用于人工絲制韌帶的制作，證明了絲素蛋白具有良好的力學(xué)性質(zhì)、生物相容性以及緩慢的降解性，是良好的支架材料［6］。

磁性Fe3O4納米粒子不僅應(yīng)用于磁記錄材料，還應(yīng)用于磁醫(yī)療及磁感應(yīng)材料等領(lǐng)域［7－9］。納米材料制備的藥物載體具有體積小、易穿透血腦屏障、在機(jī)體內(nèi)易降解等優(yōu)點(diǎn)［10］。因順磁性納米氧化鐵的表面積效應(yīng)，在其表面包覆高分子聚合物的葡聚糖形成核殼式結(jié)構(gòu)后，能進(jìn)一步制成攜帶多肽、基因或脂肪酸等，使其成為分子成像與治療順磁性的藥物載體系統(tǒng)［11］，磁性藥物微球以適當(dāng)?shù)姆绞揭肴梭w，在外加磁場(chǎng)的作用下，進(jìn)行其位點(diǎn)特異性的物理化學(xué)靶向性治療［12］。用γ－氨丙基三乙氧基硅烷修飾Fe3O4與藥物復(fù)合，對(duì)藥物的包覆具有可控性，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合效果良好［13］。文獻(xiàn)［14］使用磁性納米顆粒技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了潛伏在人體體液和組織樣本中的病毒。關(guān)于磁性材料在生物體內(nèi)的研究與應(yīng)用發(fā)展迅速，具有磁性感應(yīng)的藥物研究成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)，F(xiàn)e3O4納米粒子與有機(jī)高分子的復(fù)合成為新型藥物材料的新方法。

絲素蛋白與無(wú)機(jī)納米材料的復(fù)合仍處于初步發(fā)展階段，而合成含有磁性納米粒子的絲素蛋白復(fù)合材料在國(guó)內(nèi)外報(bào)道中并不多。利用絲蛋白作為生物載體材料具有良好的相容性與降解性以及磁性納米氧化鐵的磁感應(yīng)性，本實(shí)驗(yàn)制備含有磁性納米粒子的絲素蛋白復(fù)合材料，有望成為一種新型藥物載體材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

蠶繭（家蠶，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)研究所）；Na2CO3（國(guó)藥集團(tuán)，分析純）；LiBr（天津博迪，化學(xué)純）；透析袋（上海源葉生物科技有限公司，截留分子量14 000）；FeCl3、FeCl2·4H2O、HCl、還原性鐵粉、KOH、油酸鈉、高純氮、乙醇（國(guó)藥集團(tuán)，分析純）。

高分辨透射電子顯微鏡（JEM－2100，日本電子）；掃描式電子顯微鏡（S－4800，日立）；傅里葉紅外光譜儀（NEXUS－870，尼高力儀器公司）；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（BHV－55，理研電子株式會(huì)）。

1.2 絲素蛋白溶液制備

將剪成絲狀的蠶繭放入Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、溫度為98～100℃的水溶液中脫膠，重復(fù)上述操作2次。用90℃的熱水沖洗若干次，最后在常溫下用離子水沖洗一遍。將脫膠的絲素蛋白放置于溫度為50℃烘箱中干燥。將干燥的絲素蛋白溶解于60℃、9.5mol／L的溴化鋰溶液中，溶液經(jīng)透析72h，高速離心分離除去其中的雜質(zhì)，獲得絲素蛋白溶液。稱量法測(cè)定絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 共沉淀法制備磁性納米粒

1.3.1 油酸鈉改性

FeCl3用去離子水溶解，過(guò)濾，取濾液。FeCl2·4H2O用去離子水溶解，加入少量還原性的Fe粉、鹽酸，調(diào)節(jié)pH值為2，升溫至60℃，恒溫15min，冷卻至室溫，過(guò)濾，取濾液。取0.1g的油酸鈉，將FeCl3溶液、FeCl2溶液和油酸鈉分別注入通有氮?dú)獾娜跓恐?，邊加KOH溶液邊攪拌，至pH值為11～13，獲得黑色的溶液。陳化0.5h。對(duì)上述溶液抽濾，并用蒸餾水多次洗滌，再用乙醇多次洗滌。在60℃干燥，研磨。

1.3.2 PEG改性

取0.1g的聚乙二醇4 000，將FeCl3溶液、FeCl2溶液和聚乙二醇在堿性條件下攪拌，獲得黑色的溶液，陳化30min。對(duì)上述溶液抽濾，并用蒸餾水多次洗滌，再用乙醇多次洗滌。在60℃干燥，研磨。

1.4 絲素蛋白與磁性納米粒子的復(fù)合制備

按質(zhì)量比1∶100、1∶50取油酸鈉改性納米粒子與絲素蛋白溶液，同樣以1∶50、1∶100、1∶200取PEG改性納米粒子與絲素蛋白溶液。用乙醇在超聲條件下分散改性的納米粒子，將已經(jīng)分散的納米粒子加入到絲素蛋白溶液中超聲，直至形成固定的凝膠狀物質(zhì)。將上述凝膠狀物質(zhì)放在溫度為60℃的干燥箱中干燥。

1.5 產(chǎn)物表征

將樣品與溴化鉀研磨、壓片制樣，用NEXUS－870傅里葉紅外光譜儀測(cè)試，采樣32次，分辨率為2cm－1，測(cè)試范圍為4 000～400cm－1。分別以乙醇超聲分散油酸鈉改性納米粒子、PEG改性納米粒子、油酸鈉改性的納米粒子與絲素蛋白的復(fù)合產(chǎn)物、聚乙二醇改性的納米粒子與絲素蛋白的復(fù)合產(chǎn)物，用銅網(wǎng)撈起，用JEM－2100高分辨透射電子顯微鏡在200kV條件下檢測(cè)產(chǎn)物。對(duì)油酸鈉改性的納米粒子與絲素蛋白的復(fù)合產(chǎn)物干燥后切片，用S－4800掃描式電子顯微鏡在1.0kV條件下檢測(cè)，獲得產(chǎn)物斷面形貌照片。用BHV－55型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)油酸鈉改性的納米粒子與絲素蛋白復(fù)合干燥粉末狀物質(zhì)，獲得復(fù)合產(chǎn)物的磁滯回線。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾基團(tuán)對(duì)Fe3O4納米粒子改性的影響

樣品紅外光譜圖如圖1所示，從圖1可看出，583cm－1為氧化鐵的特征吸收峰，2 800～2 900cm－1范圍內(nèi)吸收明顯，說(shuō)明—CH2—與—CH3基 團(tuán) 較 多，2 923cm－1為 油 酸 長(zhǎng) 鏈—CH2—吸收峰，1 525cm－1為羧酸根的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1 404cm－1為C—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1 340cm－1為C—O伸縮振動(dòng)峰。結(jié)果可定性說(shuō)明油酸鈉與聚乙二醇改性Fe3O4較好。

圖1 樣品紅外光譜圖

將3組粒子在同等條件下分散在乙醇溶液中，未改性的Fe3O4納米粒子的TEM照片如圖2a所示，由圖2a可看出，納米粒子的粒徑為10nm左右，出現(xiàn)一定程度的團(tuán)聚；油酸鈉改性的Fe3O4納米粒子TEM照片如圖2b所示，油酸鈉改性的Fe3O4納米粒子粒徑在15nm左右，分散較為均勻；PEG改性的Fe3O4納米粒子TEM照片如圖2c所示，粒徑為20nm左右，團(tuán)聚現(xiàn)象明顯。由于顆粒在生長(zhǎng)過(guò)程中總是要趨向于減小表面能，所以顆粒間的聚集過(guò)程在合成階段都會(huì)發(fā)生。通常采用由表面活性劑、聚合物或其他一些有機(jī)分子結(jié)合到顆粒表面，提高立體位阻。加入油酸作為表面活性劑吸附到納米顆粒的表面，得到了能穩(wěn)定分散的納米顆粒。而PEG表面帶有大量的羥基，羥基被吸附到Fe3O4納米表面后易與其他羥基結(jié)合成團(tuán)聚結(jié)構(gòu)。

圖2 樣品的TEM照片

2.2 改性的Fe3O4與絲素蛋白復(fù)合

改性的Fe3O4與絲素蛋白復(fù)合的紅外光譜圖如圖3所示。

圖3 改性的Fe3O4與絲素蛋白復(fù)合的紅外光譜圖

由圖3可知，由于純絲素蛋白在590cm－1附近出現(xiàn)吸收峰，不能通過(guò)紅外光譜定性判斷是否改性納米粒子復(fù)合到絲素蛋白上。

油酸鈉改性和PEG改性的磁性納米粒子與絲素蛋白復(fù)合產(chǎn)物的TEM圖如圖4所示，由圖4可以看出，油酸鈉改性的磁性納米粒子在絲素蛋白表面呈點(diǎn)狀均勻分布狀態(tài)，PEG改性的納米粒子在絲素蛋白呈云狀集群分布?？梢?jiàn)經(jīng)過(guò)PEG改性的Fe3O4僅能夠在部分區(qū)域均勻分散到絲素蛋白表面，而油酸鈉改性的納米粒子點(diǎn)狀均勻分散。這是因?yàn)镻EG表面的大量羥基與絲素蛋白的表面的羥基、羧基形成氫鍵作用，已形成團(tuán)聚作用；而油酸鈉伸出的烷基鏈與絲素蛋白的殘基難以結(jié)合，故呈現(xiàn)出點(diǎn)狀分散。

圖4 油酸鈉改性和PEG改性的復(fù)合產(chǎn)物TEM圖

油酸鈉改性Fe3O4納米粒子與絲素蛋白復(fù)合產(chǎn)物的掃描電鏡照片如圖5所示。由圖5可看出，納米粒子在絲素蛋白的表面較為均勻，表面較為光滑，凹槽處是由于高能電子束打在蛋白質(zhì)上造成的。

圖5 油酸鈉改性Fe3O4納米粒子與絲素蛋白復(fù)合產(chǎn)物的SEM

油酸鈉改性Fe3O4納米粒子與絲素蛋白復(fù)合產(chǎn)物磁滯回線如圖6所示，從圖6可知，納米復(fù)合產(chǎn)物在水中分散后，在旁邊加一塊磁鐵，可以很明顯地看到復(fù)合產(chǎn)物向磁鐵方向靠近。經(jīng)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)，1g樣品經(jīng)檢測(cè)，磁飽和強(qiáng)度為0.249emu／g，剩磁為 0.047emu／g，矯頑力 為200Oe。可見(jiàn)樣品的磁性較弱，這是因?yàn)镕e3O4納米粒子與絲素蛋白的質(zhì)量比非常小。

圖6 樣品磁性圖

3 結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)紅外與透射電鏡檢測(cè)了2種不同磁性絲素蛋白材料，油酸鈉改性后的磁性納米粒子均勻分布在絲素蛋白上，PEG改性后的磁性納米粒子不均勻分布在絲素蛋白上；利用絲素蛋白良好的生物相容性及可降解性，探索絲素蛋白與磁性納米Fe3O4的復(fù)合方法。主要用途有：

（1）利用絲素蛋白包裹的磁性顆粒的外磁場(chǎng)響應(yīng)性和生物兼容性，將藥物與適當(dāng)?shù)拇呕钚猿煞峙渲迷谒幬锓€(wěn)定體系中，在足夠強(qiáng)的外磁場(chǎng)作用下，將載體定向于靶區(qū)，使其所含藥物定位釋放，集中在病變部位發(fā)揮作用。

（2）檢測(cè)到精確定位到人體內(nèi)的病毒表面蛋白或mRNA具有生物磁性，將絲素蛋白包裹的納米顆粒加入到病人體液試樣中或注射到病人身上。如果存在活的病毒，就會(huì)和納米顆粒的抗體黏結(jié)在一起，形成一大群顆粒從而被核磁共振儀器檢測(cè)到。

［1］Xu Chenjie，Xu Kemin，Gu Hongwei，et al.Nitrilotriacetic acid－modified magnetic nanoparticles as a general agent to bind histidine－tagged proteins［J］.J Am Chem Soc，2004，126（11）：3392－3393.

［2］Kohler N，F(xiàn)ryxell G E，Zhang Miqin.A bifunctional poly（ethylene glycol）silane immobilized on metallic oxidebased nanoparticles for conjugation with cell targeting agents［J］.J Am Chem Soc，2004，126（23）：7206－7211.

［3］Altman G H，Diaz F，Jakuba C，et al.Silk－based biomaterials［J］.Biomater，2003，24（3）：401－416.

［4］Hofmann S，Wong Po Foo C T，Rossetti F.Silkfibroin as an organic polymer for controlled drug delivery［J］.Journal of Controlled Release，2006，111（1／2）：219－227.

［5］Wang Yongzhong，Rudym D D，Walsh A，et al.In vivo degradation of three－dimensional silk fibroin scaffolds［J］.Biomater，2008，29（24／25）：3415－3428.

［6］Yang Yumin，Chen Xuemei，Ding Fei，et al.Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro［J］.Biomater，2007，28（9）：1643－1652.

［7］Sun Shouheng，Murray C B，Weller D，et al.Monodisperse FePt nanopar－ticles and ferromagnetic FePt nanocrystal superlattices［J］.Science，2000，287：1989－1992.

［8］Xie Jin，Xu Chenjie，Kohler N，et al.Controlled PEGylation of monodisperse Fe3O4nanoparticles for reduced non－specific uptake by macrophage cells［J］.Advanced Materials，2007，19（20）：3163－3166.

［9］Pankhurst Q A，Connolly J，Jones S K，et al.Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine［J］.J Phys D：Appl Phys，2003，36（13）：167—181.

［10］Schroeder U，Sommerfeld P，Ulrich S，et al.Sabel nanoparticle technology for delivery of drugs across the bloodbrain barrier［J］.J Pharm Sci，1998，87（11）：1305－1307.

［11］Jarzyna P A，Skajaa T，Gianella A，et al.Iron oxide core oil－in－water emulsions as a multifunctional nanoparticle platform for tumor targeting and imaging ［J］.Biomater，2009，30（36）：6947－6954.

［12］Lin Benlan，Shen Xiaodon，Cui Sheng.Application of nanosized Fe3O4in anticancer drug carriers with target－orientation and sustained－release properties［J］.Biomed Mater，2007，2（2）：132－134.

［13］Mikhaylova M，Kim D K，Berry C C，et al.BSA immobilization on amine－functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles ［J］.Chem Mater，2004，16（12）：2344－2354.

［14］McCarthy J R，Bhaumik J，Karver M R，et al.Targeted nanoagents for the detection of cancers［J］.Mol Oncol，2010，4（6）：511－528.