王 鳴 郭健文 習(xí) 東 劉君慧 葉華麗 羅小平 寧 琴

近年來(lái)，隨著基因治療技術(shù)的興起，暴發(fā)性肝炎的治療多了新的選擇?；蛑委熓且环N將外源性遺傳物質(zhì)導(dǎo)入目的器官、組織或細(xì)胞并顯示出相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，從而防治疾病的技術(shù)方法[1]。到目前為止，病毒載體在基因治療中仍然是最有效的基因?qū)胂到y(tǒng)[2]。重組腺病毒作為基因治療的重要載體之一，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）人類是腺病毒的天然宿主，所以比較安全[3]；（2）宿主范圍廣泛，能將目的基因轉(zhuǎn)移到分裂或靜息的細(xì)胞中；（3）感染細(xì)胞時(shí)病毒DNA 不整合到宿主染色體中，潛在的致癌危險(xiǎn)?。唬?）外源基因表達(dá)水平較高，滴度高，在體外穩(wěn)定，易于制備與純化。盡管如此，腺病毒載體的安全性、靶向性及有效性依然是基因治療中始終關(guān)注的問(wèn)題。本研究探討了5 型腺病毒載體介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶（LacZ）報(bào)告基因（pAd/CMV/V5-GW/LacZ）在小鼠體內(nèi)的分布和表達(dá)情況以及小鼠肝功能的變化情況，以評(píng)價(jià)腺病毒載體作為基因治療轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的有效性及安全性，為進(jìn)一步的目的基因?qū)爰氨磉_(dá)奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與病毒株 SPF 級(jí)雌性Balb/cJ小鼠 24 只，6～8 周齡，體重 20±4g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)將動(dòng)物分為正常組和暴發(fā)性肝炎組。鼠Ⅲ型肝炎病毒（MHV-3）由加拿大多倫多大學(xué)Levy 教授饋贈(zèng)。

二、細(xì)胞和腺病毒載體 293A 細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中；腺病毒載體pAd/CMV/V5-GW/LacZ 為 E1/E3 缺失型載體，購(gòu)自Invitrogen 公司。

三、X-gal X-gal 購(gòu)自 Imgenex 公司。1mg/mL X-gal 染液的配置方法為每5mL PBS 中，分別加入 164.665mg K3 Fe（CN）6（A）、211.195mg K4 Fe（CN）6·3H2O（B）和 MgCl2 475mg（C）。使用前取A、B 溶液各 100μL，C 溶液 2μL，X-gal 50μL（濃度為40mg/mL）混合，加 PBS 至終體積為2 mL。

四、病毒的包裝、擴(kuò)增和滴度滴定pAd/CMV/V5-GW/LacZ 載體經(jīng)Pac1 酶切成線性，轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞以包裝出腺病毒顆粒。用感染復(fù)數(shù)（MOI）為3～5 的病毒量感染293A 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，60h～72h 后待細(xì)胞完全出現(xiàn)病變時(shí)收獲，反復(fù)凍融3 次，離心取上清，分裝凍存于-70℃。病毒的滴度測(cè)定采用50%組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50法），即將病毒從10-3稀釋至10-10，接種生長(zhǎng)于96孔培養(yǎng)皿的293A 細(xì)胞，每個(gè)滴度接種10 孔，37℃培養(yǎng)3d，用X-gal 進(jìn)行染色，計(jì)算病毒滴度為2×108PFU/ml。

五、暴發(fā)性肝炎小鼠模型的建立 暴發(fā)性肝炎Balb/cJ 小鼠于尾靜脈注射腺病毒24h 后，腹腔注射100PFU MHV-3，在48h～96h 間出現(xiàn)暴發(fā)性肝炎表現(xiàn)。

六、尾靜脈注射 18 只Balb/cJ 小鼠為正常組注射腺病毒載體，3 只用于暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型的制備，并注射腺病毒載體，其余3 只未注射腺病毒載體作為對(duì)照（0h）。正常組小鼠尾靜脈注射腺病毒（2×108PFU/只），并于尾靜脈注射后的第24h、48h、72h、96h、120h、第 7 天隨機(jī)取 3 只動(dòng)物，取血檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素；頸椎脫臼處死動(dòng)物后，分別取肝臟、心臟、肺、腎臟，置入液氮保存，冰凍切片，X-gal 染色后，顯微鏡下觀察。確定腺病毒在體內(nèi)的表達(dá)高峰在72 小時(shí)后，模型組小鼠在尾靜脈注射腺病毒后24 小時(shí)腹腔注射100PFU 的MHV-3，以建立暴發(fā)性肝衰竭模型，并于72 小時(shí)取肝臟，液氮保存，冰凍切片，X-gal 染色后，顯微鏡下觀察。

七、腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 在光鏡下觀察，并用Image-Pro Plus5.0 病理圖文分析軟件進(jìn)行定量分析。轉(zhuǎn)染率=（截面上藍(lán)染細(xì)胞面積/所有細(xì)胞面積）×100%，取平均值。

結(jié)果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 293A 細(xì)胞感染大量腺病毒載體后均見(jiàn)細(xì)胞變圓，胞核增大，核著色加深，細(xì)胞脫落，呈葡萄串樣改變，即所謂的細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)（cell pathologic effect，CPE，圖1）。

圖1 細(xì)胞感染大量腺病毒載體后形態(tài)改變

二、腺病毒載體在正常小鼠不同臟器的分布 分別取小鼠的肝、心、肺、腎的冰凍切片進(jìn)行X-gal 染色，光鏡觀察藍(lán)綠色斑點(diǎn)為 LacZ 基因陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞群。結(jié)果顯示，僅肝臟出現(xiàn)大量的藍(lán)染的陽(yáng)性細(xì)胞，并在第72 小時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，而在其他臟器未發(fā)現(xiàn)藍(lán)染的陽(yáng)性細(xì)胞。

三、腺病毒載體在正常小鼠肝臟表達(dá)的時(shí)間規(guī)律 在尾靜脈注射腺病毒載體后不同時(shí)間，取小鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行 X-gal 染色。結(jié)果顯示：β-半乳糖苷酶于腺病毒載體注射后的第24h 即開(kāi)始在小鼠肝臟表達(dá)，第48 小時(shí)略有增加，第72h 出現(xiàn)表達(dá)高峰，約為55.7%，第96 小時(shí)表達(dá)顯著下降，第120 小時(shí)仍有少量表達(dá)，第7 天基本檢測(cè)不到目的蛋白的表達(dá)（圖2）。

圖2 腺病毒載體在正常小鼠肝臟表達(dá)的時(shí)間規(guī)律

四、腺病毒載體在暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟的表達(dá)效率 造模組于尾靜脈注射腺病毒載體后72h，取小鼠肝臟冰凍切片進(jìn)行 X-gal 染色，結(jié)果顯示β-半乳糖苷酶表達(dá)效率約為25.7%（圖3）。

圖3 腺病毒載體在暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟的表達(dá)情況

五、腺病毒注射后對(duì)小鼠肝功能的影響 正常小鼠尾靜脈注射腺病毒載體后，小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素?zé)o明顯變化。

討論

暴發(fā)性肝炎病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，預(yù)后差，病死率可高達(dá) 80%～90%。近年來(lái)，對(duì)基因治療研究的不斷深入為其開(kāi)辟了新的治療途徑?；蛑委熓且环N針對(duì)單基因和多基因遺傳病、心血管疾病、惡性腫瘤和一些傳染病的新的治療模式，方法是將外源治療基因?qū)氚屑?xì)胞，使其在體內(nèi)產(chǎn)生療效。朱傳龍等[4]用針對(duì)mfgl2 基因的反義質(zhì)粒進(jìn)行小鼠基因治療實(shí)驗(yàn)，取得較好的效果，使暴發(fā)性肝炎小鼠的生存率提高了33.3%?；蛑委熝芯康膬?nèi)容包括：①目的基因的選擇；②目的基因的克隆、測(cè)序、基因表達(dá)及其產(chǎn)物的功能特點(diǎn)研究；③目的基因轉(zhuǎn)移傳遞系統(tǒng)的研究；④目的基因表達(dá)調(diào)控研究；⑤療效及安全性研究[2]。其中，基因?qū)胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。在臨床試驗(yàn)中，病毒載體約占了70%，其中又以腺病毒和莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）為主[5]。MoMLV 是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus，RV），體內(nèi)有效的基因治療需要有足夠高的感染率，大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒載體都很難達(dá)到。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更適用于體外轉(zhuǎn)染[6]?，F(xiàn)在最常用的是缺失了整個(gè)E1A 和部分 E1B 基因的 Ad2 及 Ad5 型腺病毒載體[7]，兩者在血清學(xué)分類上均屬C 亞群，其對(duì)人的致病性主要表現(xiàn)為可以導(dǎo)致兒童上呼吸道感染，且癥狀通常是比較短暫而輕微的。腺病毒天然嗜上呼吸道上皮細(xì)胞，有研究利用腺病毒這一特性進(jìn)行囊性纖維化的基因治療[8，9]。重組腺病毒載體若直接注射到血液循環(huán)中，則主要靶向到肝細(xì)胞[10，11]。因此，對(duì)于肝臟疾病如暴發(fā)性肝衰竭的基因治療可以首先考慮腺病毒載體。如果載體使用肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，如白蛋白基因啟動(dòng)子，那么肝臟的轉(zhuǎn)基因表達(dá)將更具嚴(yán)格的靶向性[12]。但是，腺病毒的免疫原性較強(qiáng)，可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率下降[13，14]。同時(shí)，腺病毒本身還具有細(xì)胞毒性作用[15]。因此，使用腺病毒載體作為目的基因轉(zhuǎn)移傳遞系統(tǒng)必須考慮其有效性及安全性。

本實(shí)驗(yàn)研究了腺病毒載體介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶（LacZ）報(bào)告基因在正常小鼠及暴發(fā)性肝炎小鼠體內(nèi)的分布及表達(dá)情況，并檢測(cè)了小鼠肝功能的變化情況，以評(píng)價(jià)腺病毒載體作為基因治療轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的有效性及安全性，為進(jìn)一步的目的基因?qū)爰氨磉_(dá)奠定基礎(chǔ)。不同的病毒載體在不同組織細(xì)胞的表達(dá)效率與該病毒受體的多少密切相關(guān)。腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開(kāi)始。人腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，即柯薩奇/ 腺病毒受體（coxsackie/adenovirus receptor，CAR）[16]。CAR 分布廣泛，且不同種屬、組織的分布不同。在小鼠中，mCAR分布于心、肝、腦、腎、肺等，且在肝臟中表達(dá)量最高。而hCAR 在心臟和胰腺中表達(dá)最強(qiáng)，腦、小腸、睪丸、前列腺也有較高表達(dá)，肝臟、肺次之，而腎、外周血白細(xì)胞、胸腺和脾臟則未見(jiàn)表達(dá)[17]。CAR 介導(dǎo)的腺病毒進(jìn)入靶細(xì)胞是基因轉(zhuǎn)移中的限速步驟，并且轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞表面 CAR 表達(dá)水平有關(guān)。雖然CAR 廣泛分布導(dǎo)致腺病毒宿主范圍廣，但是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，腺病毒載體通過(guò)尾靜脈注射到正常小鼠體內(nèi)，主要在小鼠肝臟表達(dá)，在其他臟器基本無(wú)表達(dá)，這與上述Tomko 等[17]的研究是一致的。另外，用不同的給藥方式，腺病毒載體的分布也不同。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)尾靜脈注射到小鼠循環(huán)系統(tǒng)，而且注射體積較多，可造成小鼠一過(guò)性的心力衰竭，使腺病毒載體更加主要的靶向到肝臟。因此，其他臟器未能檢測(cè)到外源基因β-半乳糖苷酶的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，腺病毒載體在正常小鼠和暴發(fā)性肝衰竭小鼠的肝臟表達(dá)效率可達(dá)55.7%和25.7%。因此，它可作為針對(duì)肝臟疾病基因治療有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)使用。

在基因治療中，目的基因在體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間愈長(zhǎng)，其治療作用持續(xù)的時(shí)間亦愈長(zhǎng)，療效則愈加。因此，基因治療中腺病毒載體的表達(dá)時(shí)限也是衡量其有效性的另一方面。本實(shí)驗(yàn)中，腺病毒載體所介導(dǎo)的報(bào)告基因在24h 即開(kāi)始表達(dá)，并在72h 達(dá)到高峰，到120h 表達(dá)顯著下降，第7 天已基本檢測(cè)不到報(bào)告基因的表達(dá)。復(fù)制缺陷型腺病毒載體攜帶的目的基因在體內(nèi)的表達(dá)隨時(shí)間而減少，主要是因?yàn)橹亟M腺病毒不能在體內(nèi)自我復(fù)制，同時(shí)又不能將目的基因整合到染色體上，外源基因隨著細(xì)胞分裂或死亡而消失。另外，腺病毒載體在體內(nèi)表達(dá)的外源基因及自身蛋白可引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，使得腺病毒載體被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所清除，導(dǎo)致目的基因在體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間縮短。Kagami 等[18]研究提示腺病毒載體所介導(dǎo)的基因在體內(nèi)表達(dá)高峰在48h～72h，到第7～10 天表達(dá)顯著下降，兩周之后恢復(fù)到原來(lái)水平，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。腺病毒載體介導(dǎo)目的基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)較快，表達(dá)時(shí)間短暫，雖在基因治療中需反復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但此特性亦有利于急性疾病如暴發(fā)性肝炎的基因治療。

此外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了腺病毒載體注射到小鼠體內(nèi)后小鼠肝功能的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠尾靜脈注射腺病毒載體后，小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素?zé)o明顯變化，腺病毒載體對(duì)肝臟無(wú)明顯損害。腺病毒的免疫原性較強(qiáng)，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，產(chǎn)生體液反應(yīng)及強(qiáng)烈的細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13，14]。本實(shí)驗(yàn)未行這方面的檢測(cè)，但是正常小鼠尾靜脈注射腺病毒載體后，與未注射小鼠表現(xiàn)無(wú)異。因此，腺病毒載體可作為針對(duì)肝臟疾病基因治療的安全基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。

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