孫 浩，王奇志，王 鳴，馮 煦

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京210014)

四妙勇安湯是治療血栓閉塞性脈管炎的傳統(tǒng)效方，始載于清代的鮑相敖《驗方新編》中，由金銀花、玄參、當歸、甘草組成，各地多以此方為主，隨證加減，治療各型、各期患者，均取得滿意的療效，并由此方演化派生出許多針對血栓閉塞性脈管炎病變過程中各期、各型的有效方劑，在提高臨床療效方面，取得了顯著的成果被眾多醫(yī)家所推崇。本組方是在古方四妙勇安湯的基礎上加石斛、牛膝而組成，方中金銀花、玄參涼血清熱;當歸活血化瘀;石斛滋陰養(yǎng)血;牛膝活血通絡，引諸藥通達患肢;甘草調和諸藥、排毒，優(yōu)化后四妙勇安湯在治療心腦血管方面療效更加明確。組方經水提醇沉，乙酸乙酯萃取，酯浸膏水能溶部分為其治療心腦血管的有效部位，本文對該有效部位中總黃酮進行定量分析，采用紫外可見分光光度法，以蘆丁為對照品，以硝酸鋁為顯色劑，檢測波長為510 nm波長，為四妙勇安湯加石斛、牛膝復方治療心腦血管有效部位總黃酮的含量測定提供一種操作簡單、科學準確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

紫外可見分光光度計(島津UV－2501型);電子天平(Sartorius BP211D)。HH一6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。容量瓶、移液管:天津市天波玻璃儀器有限公司。

1.1.2 試藥

蘆丁對照品(批號:100080－200707，供含量測定用，純度為92.5%)，購自中國藥品生物制品檢定所;水為樂百氏純凈水;亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，無水乙醇，甲醇，冰醋酸(均為分析純，上海久億化學試劑有限公司)。四妙勇安湯治療血栓有效部位自制。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，用甲醇超聲溶解制成濃度為0.15 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

取金銀花30 g、玄參30 g、石斛30 g、牛膝30 g、當歸30 g、甘草15 g，每次加水600 mL，70℃熱提3次，合并提取液，減壓濃縮至小體積，加醇進行醇沉，減壓濃縮醇溶液至無醇味，混懸與水，用乙酸乙酯萃取得酯浸膏，加水進行水沉，水溶解部分為治療血栓的有效部位。定容至100 mL即得供試品溶液。

1.2.3 檢測波長的選擇

分別精密移取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各1 mL分別置于10 mL量瓶中，加30%乙醇約至5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，在200～800 nm全波長掃描，結果確定檢測波長為510 nm。

1.2.4 線性關系的考察

精密移取對照品溶液 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，以零管為空白，用1 cm的比色杯，在510 nm處測定吸光度，繪制蘆丁含量與吸光度的標準曲線，以吸收度對濃度進行回歸分析，標準曲線方程為:Conc=K1A+K0，K1=88.34，K0= －0.868，Chi－ Square:0.00044。y=0.1697926x+0.009835，r=0.9997，線性工作范圍:0～0.0612 mg/mL。

1.2.5 重復性試驗

取同一份樣品，置10 mL量瓶中，平行5份，用30%乙醇稀釋至刻度，按“1.2.4”的方法在510 nm處測定其吸收度，結果平均含量(%)=36.37，RSD=1.91%(n=5)。

1.2.6 精密度試驗

精密吸取同一份供試品溶液，顯色后，以空白溶劑作為參比，在相同條件下510 nm處連續(xù)測定其吸光度5次。計算平均吸收度和RSD值，結果RSD為0.72%，表明精密度良好。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液，顯色后，以空白溶劑作為參比，在 510 nm 處，分別在 0、10、20、30、40、50、60 min測定其吸光度，計算60 min內的RSD，結果RSD為0.82%，表明在60 min內顯色基本穩(wěn)定。

1.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取蘆丁對照品0.1997 g(純度為92.5%)，置于50 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為3.994 mg/mL的蘆丁對照品液。取已知含量的同一供試品，平行6份，置于10 mL量瓶中，精密加入蘆丁對照品液，用30%乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，按“1.2.4”的方法加入顯色劑，以試劑為空白對照，在510 nm處分別測定其吸光度。計算加樣回收率，結果平均回收率為99.60%，RSD:0.84%(n=6)。

1.2.9 樣品含量測定

按“1.2.2”的方法分別制備6批供試品溶液，置10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，以試劑為空白對照，于紫外分光光度計510 nm處測定吸收，將吸光度代入標準曲線中計算總黃酮含量，有效部位中總黃酮的平均含量為37.76%。

表1 加樣回收率實驗結果

表2 有效部位中總黃酮的含量測定

2 結論與討論

(1)為考察隨機變動因素對含量測定結果的影響，取同一供試品，通過3個不同操作者在同一臺紫外可見分光光度計上，按筆者擬定的含量測定方法分析供試品中以蘆丁計的總黃酮含量，結果3個操作者測得的平均總黃酮含量為37.96%，RSD=2.03%。這表明該方法的精密度高，穩(wěn)定可靠。

(2)采用可見分光光度法測定四妙勇安湯加石斛、牛膝治療血栓有效部位中有效部位總黃酮的含量，具有準確度高、重復性強和線性范圍廣等優(yōu)點。該方法操作簡單，分析速度快，投入成本低，適合用于四妙勇安湯加石斛、牛膝治療血栓有效部位中總黃酮的含量測定和質量控制。

［1］國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:902.

［2］國家藥典委員會.中國藥典(—部)［S］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:246.

［3］陳卓，宋娟，周熙艷，等.四妙勇安湯抗炎有效部位中總黃酮的含量測定［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2007，23(6):385－387.