張利國 ,宋憲友*,房郁妍,鄭楠 ,吳廣文,

（黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所，哈爾濱150086）

大麻是一種古老的栽培作物，有重要的工業(yè)、農用及藥用價值，特別在紡織業(yè)和建筑業(yè)上，具有其它作物所不可替代的獨特優(yōu)勢[1]，現已成為許多國家著力發(fā)展的重要經濟作物。

多年來國內大麻育種研究工作主要集中在如何提高出麻率方面,而大麻經長期的異花授粉導致遺傳背景非常復雜，遺傳學與分子生物學的基礎研究比較少，在改良纖維品質上的研究十分薄弱，一些問題難以通過傳統(tǒng)的育種方法加以解決，比如改變不同類型木質素的比例、使之更易去除，基因工程等現代生物技術是解決這些問題的高效工具[2]。大麻 (Cannabis sativa L.),屬大麻科(Cannabaceae)，其再生體系與亞麻等其它麻類相比應存在一定的特異性，良好的大麻再生體系對大麻的遺傳轉化、單倍體培養(yǎng)等具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料：龍大麻一號

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒

選取成熟的大麻新種子，用70%的乙醇消毒0.5～1.0min，無菌水沖洗 3～4遍；再用10%的 Na－ClO浸泡8～24 min，無菌水沖洗 4～5遍，然后在無菌條件下浸種 16～24 h，種皮吸水脹裂后，接種于 1/2MS培養(yǎng)基上，在24±1℃、光強 1800～2300 lx、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)待用。

1.2.2 愈傷組織的誘導及芽的分化

切取7～19 d的大麻無菌苗下胚軸，接種于不同激素組合的愈傷組織誘導及分化培養(yǎng)基上，誘導愈傷組織形成及芽的分化。每個培養(yǎng)皿接種約4-8個外植體，2次重復，培養(yǎng)條件與無菌苗的獲得一致，繼代頻率為每周1次。為了選擇最佳的ZT濃度，進行了ZT的濃度梯度試驗（0、0.6、1.1、2.0、5.0 mg·L-1），配合以 0.2mg/l的 IAA。

愈傷組織誘導及芽分化培養(yǎng)基（所有培養(yǎng)基瓊脂 0.8%，3%蔗糖，pH 5.8）：（1）MS+IAA1.1 mg·L-1+ZT 1.1mg·L-1；（2）MS+IAA0.2 mg·L-1+ZT 1.1 mg·L-1；（3）MS+IAA0.2 mg·L-1+ZT 2.0 mg·L-1；（4）MS+IAA 0.2mg·L-1+ZT 5.0 mg·L-1；（5）MS+IAA 0.2(1.1)mg·L-1+ZT0.6mg·L-1；（6）MS+IAA 0.2 mg·L-1+BA 2.0 mg·L-1。1.2.3 生根培養(yǎng)

將胚軸上形成的多個不定芽從基部切下，接種到不同的生根培養(yǎng)基當中。培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，分別加入 0.015、0.05、0.1、0.15、0.2mg·L-1的 IAA、NAA 和 IBA。

2 結果與分析

2.1 不同的消毒時間對組織培養(yǎng)的影響

研究采用10%次氯酸鈉作為消毒劑。發(fā)現10%的次氯酸鈉消毒18min以上殺菌效果較好，消毒18min、21min、24min，發(fā)芽率分別為91%、87%、82%，但21min、24min無菌苗的生理狀態(tài)不佳（見表1），對以下的組織培養(yǎng)及轉化工作不利，因此選擇10%的次氯酸鈉消毒18min，以減少消毒劑對種子的毒害。

表1 次氯酸鈉處理對種子發(fā)芽的影響Tab.1 Effects of different NaClO concentrations and time on germinating seeds

2.2 ZT濃度對下胚軸不定芽誘導的影響

對于大麻的愈傷和不定芽誘導來說，ZT是一種十分有效的分裂素。它的誘導率可達到BA的2-3倍，為了選擇最佳的ZT濃度，進行了ZT的濃度梯度試驗，配合以0.2mg/l的IAA。由圖1可以看出，隨著ZT濃度的升高，不定芽誘導率逐漸升高，0.6mg/LZT的不定芽誘導率最高，可達57.70%，ZT濃度繼續(xù)升高，不定芽誘導率逐漸降低。

2.3 苗齡對離體培養(yǎng)再生的影響

大麻下胚軸放在適合的愈傷誘導分化培養(yǎng)基（見后）上培養(yǎng)后，兩邊切口處漸漸膨大，形成愈傷組織（圖2），在愈傷組織不斷生長的同時，其表面逐漸變?yōu)榈G色，同時出現綠色芽點，芽點不斷生長，形成不定芽（圖3）。在同一培養(yǎng)條件下，苗齡不同，形成愈傷組織和不定芽的狀況也不同。對7天、10天、13天、16天、19天的苗齡進行對比試驗，發(fā)現7天苗齡植株由于外植體相對比較幼嫩，愈傷形成率很低，僅為8.21%；19天苗齡外植體生長緩慢，愈傷形成率及芽分化率大大降低，下胚軸的芽分化率為27.39%。13天苗齡的下胚軸分化率最高，可達58.17%，10天和16天苗齡的外植體分化率較高，9天苗齡下胚軸分化率為45.22%，16天苗齡下胚軸分化率為50.75%。因此，選擇適當苗齡的外植體是獲得高頻率離體再生的基礎。

圖1 ZT濃度對下胚軸不定芽誘導的影響Fig.1 Effect of ZT concentrations on inducing adventitious shoots of hypocotyl

2.4 不同激素組合對愈傷誘導和不定芽伸長的影響

圖2 愈傷的逐漸膨大Fig.2 Swollen calli

圖3 愈傷和不定芽的誘導Fig.3 Inducted calli and adventitious shoots

圖4 不定芽的伸長Fig.4 Elongated adventitious shoots

不同激素組合及濃度都會影響愈傷形成及芽分化。本試驗使用了BA、ZT兩種激動素和不同濃度的IAA組合，發(fā)現愈傷誘導及芽分化率有很大不同。BA、ZT和IAA的組合，均能誘導大麻外植體的分化，其中ZT 1.1mg/l和IAA 1.1mg/l的組合對愈傷誘導效果最好，下胚軸的出愈率能達到87%，當ZT濃度大于1.1mg/l時，隨著ZT濃度的升高，不定芽誘導率逐漸降低。以ZT 0.6mg/l和IAA 1.1mg/l的組合對芽的伸長相對效果較好,芽的分化率可達61.32%（表2）。

表2 不同激素組合對下胚軸愈傷誘導和芽分化率的影響Tab.2 Effects of different hormones on the frequencies of calli induction and bud differentiation

2.5 不同生長素種類及濃度對生根的影響

分化出的芽長至2-3cm時（圖4），將外植體上形成的多個不定芽從基部切下，插入不同的生根培養(yǎng)基中。研究發(fā)現，1/2MS培養(yǎng)基及加入低濃度生長素的1/2MS培養(yǎng)基，生根效果較好。IAA、IBA、NAA三種激素對生根的影響差別較大（圖5）。較低濃度的IAA和IBA生根能力明顯強于NAA(圖 6)。

圖5 不同激素及其濃度對生根的影響Fig.5 Effect of different hormones and concentrations on rooting

圖6 不定芽的生根Fig.6 Rootings of adventitious shoot

3 結果與討論

次氯酸鈉會影響植物幼苗的生長[3]，還可能促進體細胞胚胎的發(fā)生[4]，因此，在選擇消毒時間時，應當考慮消毒劑的生理影響。綜合考慮，大麻的種子消毒較優(yōu)化條件為，70%酒精消毒1min，10%的次氯酸鈉消毒18min。

由于大麻種皮較厚，消毒后不易萌發(fā)，因此，消毒后選擇無菌條件下浸種16～24 h，種皮破裂露白后再接種于1/2MS培養(yǎng)基上，取得了較好效果。此外發(fā)現，使用當年的新種子在同一條件下消毒效果好，如果是陳種子應當在曬干后，適當延長消毒時間與增加消毒劑濃度。對龍大麻一號來說，消毒21分鐘以上，雖然滅菌效果和清除殘留物效果較好，但會出現幼苗的異常生長，因而在選擇消毒時間時，還應當注意消毒劑的生理影響。

龍大麻一號適合的再生條件為，1.1mg/L ZT和IAA 1.1mg/l的愈傷及芽的誘導率最高，采用13天苗齡的下胚軸、試驗設計中ZT0.6mg/l和IAA 1.1mg/l的組合較適合不定芽的伸長，低濃度的IAA和IBA生根能力均較強，0.05%IAA生根能力最好。

[1] 張利國.大麻三個農家品種的核型分析與比較研究[J].中國麻業(yè)，2009，31（1）：11.

[2] 關鳳芝.大麻遺傳育種與栽培技術[M].哈爾濱：黑龍江人民出版社，2010.

[3] Inouhe M,Nevius D J.Auxin-enchanced glucan autohydrolysis in maize coleoptile cell walls[J].Plant Physiol,1991,96(1):285.

[4] Goudey J S,Tittle F L,Spencer M S.Effects of hypochlirite disin-fection on the response of barley alourone layer to gibberellic acid[J].Pysiol Plant,1987,69(2):295.