周曉靜，白素芬，李 欣，閆鳳鳴

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002)

棉蚜是世界性的棉花重要害蟲(chóng).發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，排泄的蜜露污染棉葉和棉纖維，引起煤污病的發(fā)生，嚴(yán)重降低棉花的產(chǎn)量和品質(zhì).長(zhǎng)期以來(lái)，世界各國(guó)都在致力于棉花抗蚜品種的選育，并力求通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蚜水平高的轉(zhuǎn)基因棉.抗蚜棉的選育必然涉及到抗蚜性鑒定，目前，有關(guān)抗蚜分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)主要以蚜口密度減退率或蚜害指數(shù)減退率作為依據(jù)［1］.然而，蜜露作為棉蚜代謝的最終產(chǎn)物，1頭棉蚜整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段排泄的蜜露可達(dá)2 220 μg，占其取食總量的70%以上［2］，排蜜量的多少能夠反映棉蚜取食量的大小.已有的研究［3］還表明，蚜蟲(chóng)蜜露的排泄受寄主植物營(yíng)養(yǎng)水平的影響顯著，與不同材料的抗性密切相關(guān).田間蚜蟲(chóng)發(fā)生量大的材料，蚜蟲(chóng)排蜜量大;相反，排蜜量小.芥蚜取食含有麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)的人工飼料后，排泄的蜜露減少40%;取食轉(zhuǎn)wga基因的印度芥后，與受體親本相比，排泄的蜜露量顯著下降，說(shuō)明wga基因的表達(dá)，抑制了蚜蟲(chóng)的取食.進(jìn)一步的研究表明，伴隨排蜜量的下降，芥蚜的死亡率增加和生殖力下降［4］.國(guó)際水稻研究所已將蜜露檢測(cè)作為評(píng)價(jià)水稻材料是否抗褐飛虱的一個(gè)簡(jiǎn)易指標(biāo).劉光杰等［5］通過(guò)白背飛虱(Sogatella furcifera)蜜露量，結(jié)合田間自然蟲(chóng)量調(diào)查獲得了水稻材料抗白背飛虱的定量指標(biāo)，證明蜜露量測(cè)定法可以用來(lái)測(cè)定水稻材料對(duì)白背飛虱的抗性水平.由此可見(jiàn)，蜜露可以反映寄主植物對(duì)蚜蟲(chóng)、飛虱等昆蟲(chóng)取食的影響，檢測(cè)其排泄的蜜露量，可以作為評(píng)價(jià)寄主抗性的一個(gè)重要指標(biāo).有關(guān)蜜露量的測(cè)定方法較多，如蜜露滴計(jì)數(shù)法、蜜露色斑面積法即半定量法、稱(chēng)量法和比色法等.但是，何種方法更準(zhǔn)確、有效、簡(jiǎn)易未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道.本研究采用半定量法、稱(chēng)量法和比色法，比較了棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉花后排泄的蜜露量，以期篩選出簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的蜜露檢測(cè)方法，為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉或棉花抗蚜材料的選育提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 供試棉花

供試棉花材料10個(gè)，即轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉H2和其親本中棉12，轉(zhuǎn)Bt和CpTI基因抗蟲(chóng)棉中棉41和其親本中棉23，轉(zhuǎn)凝集素基因抗蟲(chóng)棉8008和其親本蘇006，轉(zhuǎn)凝集素基因抗蟲(chóng)棉8009和其親本蘇011，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)雜交棉晉棉34和常規(guī)棉太8作為棉蚜的取食寄主.10個(gè)棉花材料均在室內(nèi)同期播種于花盆中，栽培、管理措施一致，苗期用于試驗(yàn).

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

棉蚜于2011－06采自河南原陽(yáng)農(nóng)科院試驗(yàn)基地.棉蚜飼養(yǎng)方法參照劉樹(shù)生［6］的新的葉子圓片法加以改進(jìn)，即將20 mL瓊脂培養(yǎng)基(每1 L蒸餾水加2.5 mg 100萬(wàn)單位硫酸鏈霉素，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂配制而成)倒入容器內(nèi)，容器選用無(wú)毒、透明的塑料杯，口徑為8.7 cm，底部直徑為5.5 cm，高為4 cm.然后將整片棉葉的正面貼在培養(yǎng)基表面，接蚜后，將整個(gè)容器倒扣在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿上.置于(25±1)℃，相對(duì)濕度60% ～70%，光周期L∶D=14∶10的人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng).用此法飼養(yǎng)的棉蚜與在棉株上自然生長(zhǎng)的棉蚜的個(gè)體大小和壽命沒(méi)有明顯差異，而且棉葉在培養(yǎng)基上能夠保綠10 d以上.

1.3 蜜露的檢測(cè)

1.3.1 半定量法－蜜露色斑面積法 在棉花苗期，挑取室內(nèi)各棉花材料上飼養(yǎng)10代的無(wú)翅雌成蚜接在相應(yīng)棉花材料葉片的背面(如前述，采用離體葉片飼養(yǎng)法)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)留5頭初產(chǎn)仔蚜作為初始蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至3齡或4齡時(shí)，在棉葉下方的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的茚三酮浸泡并烘干的濾紙，24 h后取出濾紙，拍照并用九宮格坐標(biāo)紙測(cè)量濾紙上斑點(diǎn)面積.每個(gè)棉花材料重復(fù)3次.

1.3.2 定量法－稱(chēng)量法 在棉花苗期，挑取室內(nèi)各棉花材料上飼養(yǎng)10代的無(wú)翅雌成蚜，接在相應(yīng)材料棉花葉片的背面，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)留15頭初產(chǎn)仔蚜作為初始蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至2齡時(shí)，在棉葉下方的培養(yǎng)皿內(nèi)放置已稱(chēng)重的Parafilm膜，72 h后取出膜用電子天平稱(chēng)重(精確度0.000 1 g)，2次膜質(zhì)量的差值即棉蚜取食該棉花材料后排泄的蜜露量.

1.3.3 比色法

1.3.3.1 氨基酸最大吸收峰的確定 稱(chēng)量2.879 mg脯氨酸溶于 300 μL 溴甲酚綠(0.001 g·mL－1)，再加3 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇后用Spectrum756型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在570～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)比色，以確定氨基酸最大吸收峰的波長(zhǎng).1.3.3.2 棉蚜不同種群密度的排蜜量 分別接50，80，110頭3齡若蚜于中棉12的棉葉上，在棉葉下方鋪Parafilm膜，48 h后取出膜，用300 μL溴甲酚綠分2次在膜上收集蜜露再轉(zhuǎn)移到試管中，再用3.4 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇分2次洗脫后集中在試管中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其在628 nm下的吸光度值.

1.3.3.3 棉蚜取食不同棉花材料后排蜜量的檢測(cè)

在供試的10個(gè)棉花材料的棉葉上接成蚜，待其產(chǎn)夠15頭若蚜后移除成蚜，當(dāng)若蚜發(fā)育至2齡時(shí)，在棉葉下方放置Parafilm膜收集蜜露，72 h后取出膜，排蜜量測(cè)定方法同 1.3.3.2.

1.4 數(shù)據(jù)分析

各處理平均數(shù)間的比較采用Duncan’s新復(fù)極差法.

棉蚜排蜜量減少率X=［Y1(OD對(duì)照受體親本)－Y2(OD轉(zhuǎn)基因棉)］/X1(對(duì)照受體親本上的棉蚜數(shù)).

2 結(jié)果與分析

2.1 半定量法反映棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化

棉蚜在取食所有供試的10個(gè)棉花材料后均能正常排泄蜜露，排泄蜜露量的多少與取食量大小呈正比.通過(guò)半定量法即測(cè)量棉蚜取食后排泄蜜露的色斑面積，即可從蜜露色斑的面積差異反映其取食量的差異.

由表1可以看出，供試的10個(gè)棉花材料對(duì)棉蚜的取食產(chǎn)生不同的影響，反映在棉蚜取食后蜜露的排泄量呈現(xiàn)差異，它們對(duì)棉蚜的適合性依次為中棉12＞8009＞中棉41＞H2＞蘇011＞中棉23＞8008＞蘇006＞晉棉34＞太8，其中中棉12最適合棉蚜的取食，其上棉蚜的排蜜量最高，蜜露色斑面積為105.67 mm2.與之相反，常規(guī)棉太8對(duì)棉蚜取食有一定的抑制作用，其上棉蚜的排蜜量最少，僅為18.67 mm2.取食轉(zhuǎn)外源凝集素基因棉8008，與其親本蘇006相比，棉蚜排蜜量增多，說(shuō)明該凝集素并未發(fā)揮抗蚜作用.以上各轉(zhuǎn)基因棉與其受體親本相比，除8008與其親本蘇006外，抗蚜性差異均未達(dá)到顯著水平.

表1 取食不同轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜排蜜量的影響Table 1 Effects of different transgenic cottons on the honeydew excretion by Aphis gossypii

2.2 稱(chēng)量法反映棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化

待棉蚜在各供試棉花材料上取食一定時(shí)間后，富集在膜上的蜜露量積累到可以檢測(cè)的水平，此時(shí)稱(chēng)量膜的質(zhì)量，獲得棉蚜的排蜜量.

由表2得出，取食中棉12棉蚜的排蜜量最高，取食太8排蜜量最少，取食轉(zhuǎn)外源凝集素基因棉8008，與其親本蘇006相比，排蜜量更多，更適合棉蚜的取食.該結(jié)果與上述半定量法的測(cè)定結(jié)果基本一致，說(shuō)明稱(chēng)量法和半定量法均能較好的反映棉花材料或轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜取食后蜜露分泌的影響.

表2 棉蚜取食10個(gè)棉花材料后的排蜜量Table 2 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on ten cotton varieties

2.3 比色法反映取食不同轉(zhuǎn)基因棉后對(duì)棉蚜排蜜量的影響

2.3.1 氨基酸最大吸收峰波長(zhǎng)的確定 為確定溴甲酚綠比色法測(cè)定氨基酸的最大吸收峰時(shí)的波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)范圍570～700 nm條件下進(jìn)行測(cè)定，如圖1顯示，氨基酸最大吸收峰時(shí)的波長(zhǎng)為628 nm，故選擇628 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

圖1 不同波長(zhǎng)下脯氨酸的吸光度值Fig.1 The absorbance value of proline at different wave length

2.3.2 蚜口密度與棉蚜排蜜量的相關(guān)性 理論上，棉蚜蚜口密度與其排泄的蜜露量呈正相關(guān)性，即蚜口密度高時(shí)，排蜜量大;否則，排蜜量小.

由圖2可知，采用比色法很好地反映了棉蚜在不同蚜口密度的排蜜量，排蜜量與蚜口密度的回歸方程為:y=0.013 5x－0.532 3.x為蚜蟲(chóng)數(shù)量，y為吸光度值.

圖2 棉蚜不同蚜口密度與其排蜜量的相關(guān)性Fig.2 The relationship between aphid density and honeydew production

二者成顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998 8.由此可見(jiàn)，用此法可檢測(cè)棉蚜取食不同棉花材料或轉(zhuǎn)基因棉后，蚜口密度的增長(zhǎng)情況，排蜜量大，則相應(yīng)的蚜口密度也高;相反，則蚜口密度低.

根據(jù)棉蚜排蜜量與蚜口密度的相關(guān)性，可以計(jì)算出蚜口密度減退率達(dá)20%時(shí)，棉蚜排蜜量的減少率 X=0.002 7.

其中，X=［Y1(OD對(duì)照受體親本)－Y2(OD轉(zhuǎn)基因棉)］/X1(對(duì)照受體親本上棉蚜數(shù)).

蚜口密度減退率為80%時(shí)，棉蚜排蜜量的減少率為 X=0.010 8.

由此推測(cè)出轉(zhuǎn)基因棉抗蚜分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3.

2.3.3 棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后排蜜量的變化采用溴甲酚綠比色法測(cè)定棉蚜取食各轉(zhuǎn)基因棉后的排蜜量，結(jié)果見(jiàn)表4.

表3 轉(zhuǎn)基因棉對(duì)棉蚜抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(排蜜量減少率)Table 3 The criterion of resistant classification of transgenic cottons to aphid(reduction of honeydew excretion by Aphis gossypii)

表4 棉蚜取食不同轉(zhuǎn)基因棉后的排蜜量Table 4 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on different transgenic insect resistant cottons

由表4可知，棉蚜取食中棉12的排蜜量最大，而取食太8后排蜜量最小，取食其他材料后的排蜜量與上述半定量法和稱(chēng)量法的趨勢(shì)基本一致，這表明3種方法檢測(cè)不同棉花材料對(duì)棉蚜取食的影響基本吻合，從供試的10個(gè)棉花材料中可以反映出中棉12的抗蚜性最低.

綜合分析上述3種蜜露檢測(cè)法，均能很好地反映供試的棉花材料對(duì)棉蚜取食后蜜露代謝的影響，由此能較準(zhǔn)確地篩選出具有抗蚜能力的材料.相比之下，比色法因其準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單方便和靈敏的特點(diǎn)而優(yōu)于其他2種檢測(cè)法.

3 結(jié)論與討論

很多以刺吸植物韌皮部汁液為食的同翅目昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)、飛虱、粉虱等以蜜露的方式將多余的養(yǎng)分如氨基酸和糖分排出體外，排蜜量的多少與其取食的寄主植物的抗生性密切相關(guān)，蜜露檢測(cè)因而成為鑒定植物抗性水平的重要途徑.蜜露的主要成分是糖和氨基酸，因此，國(guó)內(nèi)外很多研究者多用溴甲酚藍(lán)(綠)和茚三酮法進(jìn)行檢測(cè)，并以排蜜量減少的程度反映轉(zhuǎn)基因作物對(duì)昆蟲(chóng)取食的影響.用溴甲酚綠顯色法，NAGADHARA等［7］發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn) gna基因水稻的白背飛虱排泄的蜜露量減少了88%，與對(duì)照受體親本相比，差異達(dá)極顯著水平 (P＜0.01).同樣，用茚三酮法也證實(shí)了芥蚜取食轉(zhuǎn)wga基因的芥后，排泄的蜜露減少，這說(shuō)明表達(dá)的WGA抑制了芥蚜的取食［4］.此外，將收集的蜜露通過(guò)蛋白印跡法還能檢測(cè)出取食昆蟲(chóng)排泄的蜜露中是否含有外源凝集素.與取食未轉(zhuǎn)化的親本相比，只有取食轉(zhuǎn)wga基因芥的芥蚜排泄的蜜露中才能檢測(cè)出WGA，這說(shuō)明該植物韌皮部汁液中確實(shí)有表達(dá)的WGA，進(jìn)而也表明，有未經(jīng)消化的WGA從芥蚜腸道排出［4］.蜜露成分分析主要是對(duì)蜜露中糖和游離氨基酸的定性和定量分析.楊益眾等［8］研究了棉蚜取食2個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因棉和1個(gè)轉(zhuǎn)Bt及CpTI基因棉后，發(fā)現(xiàn)蜜露的排泄與取食對(duì)照親本相比分別減少22.67%，40.54% 和 30.0%，棉蚜取食轉(zhuǎn)基因棉花后蜜露中游離氨基酸的總量均高于對(duì)照親本，蜜露中可溶性總糖、蔗糖和各種氨基酸含量在取食轉(zhuǎn)基因棉和常規(guī)棉花材料間存在一定差異.分析刺吸式口器昆蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物后的排蜜量及其營(yíng)養(yǎng)成分的變化，可以探討轉(zhuǎn)基因作物對(duì)刺吸式昆蟲(chóng)取食和代謝的影響，從而成為鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因作物抗蟲(chóng)性的重要檢測(cè)指標(biāo).

蜜露作為反映作物材料或轉(zhuǎn)基因作物的抗蚜性指標(biāo)已被廣泛認(rèn)可.縱觀國(guó)內(nèi)外采用的幾種檢測(cè)方法，作者進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蜜露色斑面積法、稱(chēng)量法和比色法均能反映各供試棉花材料的抗蚜性差異，所測(cè)結(jié)果反映的抗蚜性差異基本一致，說(shuō)明這些方法均可以加以應(yīng)用.但是，測(cè)量蜜露色斑面積時(shí)發(fā)現(xiàn)，即便面積相同，色斑卻深淺不一，這說(shuō)明含量的差異被忽略了.稱(chēng)量法則需達(dá)到天平的檢測(cè)范圍，這需要相對(duì)較長(zhǎng)的接蚜?xí)r間或較大的蚜口密度.而比色法則無(wú)上述問(wèn)題，操作既簡(jiǎn)便，又比較精確.而且，用該法還能反映棉蚜排蜜量與蚜口密度的關(guān)系，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998 8，經(jīng)與抗蚜性級(jí)別的轉(zhuǎn)換，能推測(cè)出相應(yīng)的抗蚜評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn).探索出快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易的蜜露檢測(cè)方法將為轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲(chóng)性評(píng)估提供重要的簽定依據(jù).

［1］ 肖松華，劉劍光，吳巧娟，等.轉(zhuǎn)外源凝集素基因棉花對(duì)棉蚜的抗性鑒定［J］.棉花學(xué)報(bào)，2005，17(2):72－78.

［2］ 張克斌，董家倫，翟延路.以14C標(biāo)記棉花研究棉蚜取食、排泄、吸收與棉花材料抗蚜性關(guān)系［J］.原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用，1985(3):37－40.

［3］ 郭貴明，蘇芝業(yè)，楊倫倫，等.麥長(zhǎng)管蚜蜜露分泌量與小麥材料的關(guān)系研究初報(bào)［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1993，16(2):228－231.

［4］ KANRAR S，VENKATESWARI J，KIRTI P B，et al.Transgenic Indian mustard(Brassica juncea)with resistance to the mustard aphid(Lipaphis erysimi Kalt.)［J］.Plant Cell Rep，2002，20:976 －981.

［5］ 劉光杰，沈君輝，寒川一成，等.水稻材料抗白背飛虱鑒定的定量指標(biāo)［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2003，30(2):153－160.

［6］ 劉樹(shù)生.介紹一種飼養(yǎng)蚜蟲(chóng)的方法——新的葉子圓片法［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，1987，24(2):113－116.

［7］ NAGADHARA D，RAMESH S，PASALU I C，et al.Transgenic rice plants expressing the snowdrop lectin gene(gna)exhibit high-level resistance to the whitebacked planthopper(Sogatella furcifera)［J］.Theor Appl Genet，2004，109:1399 －1405.

［8］ 楊益眾，陸宴輝，薛光杰，等.轉(zhuǎn)基因棉花中糖類(lèi)和游離氨基酸含量的變化對(duì)棉蚜泌蜜量及蜜露主要成分的影響［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2005，48(4):491－497.