武 棟

（山西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，山西 太原 030002）

1 引言

氯霉素（chloramphenicol，以下簡稱 CAP）為1947年從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomycesvenezuela）的培養(yǎng)濾液中分離出的結(jié)晶性抗菌素，是第一個采用化學合成法生產(chǎn)的抗生素，是一種有效的廣譜抗生素，對多種病原菌有較強的抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，常用氯霉素治療各種傳染性疾病，但同時也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴重問題。研究表明，氯霉素有嚴重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥、新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性。因此，氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視，歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標準為“零允許量”，即不得檢出。

從20世紀90年代起，隨著山西省水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速向高密度集約化方向發(fā)展，養(yǎng)殖水域自身污染日益加重，養(yǎng)殖病害日趨增多，濫用漁藥、化肥、飼料、飼料添加劑等漁業(yè)投入品的現(xiàn)象屢禁不止，加之工礦企業(yè)和生活排污對養(yǎng)殖水域造成一定的污染，導致養(yǎng)殖水產(chǎn)品品質(zhì)下降，給漁業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營造成極大損失，對消費者的健康產(chǎn)生不利影響。為此，加強水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控已勢在必行。

水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控要以源頭治理為重點，嚴把漁業(yè)投入品尤其是藥物使用關，大力推進漁業(yè)標準化生產(chǎn)；以推進市場準入制度和無公害水產(chǎn)品認證為契機，實現(xiàn)水產(chǎn)品質(zhì)量安全全程可追溯管理；依照國家法律法規(guī)和有關標準，對水產(chǎn)品（包括產(chǎn)地環(huán)境和漁業(yè)投入品）質(zhì)量安全實施監(jiān)測檢測。下面以酶聯(lián)免疫法對全省69個水產(chǎn)養(yǎng)殖場的132份水產(chǎn)品進行氯霉素藥物殘留檢測。

2 材料與方法

2.1 樣品及儀器

本次共抽檢132個樣品，其中鯉魚54個、草魚49個、虹鱒魚13個、鰱魚10個、鳙魚6個，樣品取自山西省的69個水產(chǎn)養(yǎng)殖場。

實驗儀器采用MK3酶標儀，試劑采用氯霉素酶聯(lián)免疫反應測試盒（美國REAGEN）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品采集

每個樣品均抽取3尾魚，去鱗去皮取背部肌肉絞碎混合均勻；試樣量為400g，分為兩份，其中一份用于檢測，一份作為留樣。

2.2.2 樣品前處理

取適量樣品用組織搗碎機搗碎，稱3g搗碎樣品置50mL離心管中，加入6mL乙酸乙酯，以最大轉(zhuǎn)速旋渦振蕩3min；25℃下離心力4000g、離心5min；移取4mL乙酸乙酯上清液至玻璃管中，在60℃～70℃水浴氮氣吹干；在玻璃試管中加入2mL正己烷完全溶解干燥物，再加入1mL單倍SampleEstractionBuffer，旋渦振蕩2min；25℃下離心力4000g、離心10min，去除上層正己烷層，下層液作為樣品液備用。

2.2.3 檢測步驟

取100μL的標準品和樣品液于所設定的孔中，在每孔中加入50μLCAP-HRPConjugate，輕敲微孔板邊緣混勻30s，25℃避光孵育1h。將微孔中液體甩掉，每孔加入250μL單倍WashSolution洗板，重復3次，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上拍干。每孔加入 100μL的 TMBSubstrate，25℃避光孵育 15～20min，加入 100μL的 StopBuffer，用酶標儀在450nm波長下讀取數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 氯霉素標準曲線

以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度為橫坐標建立標準曲線，從標準曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值。氯霉素標準品檢測結(jié)果見表1。據(jù)圖1得出，相關系數(shù)為0.9913。

表1 氯霉素標準品檢測結(jié)果

圖1 氯霉素標準曲線

3.2 樣品檢測結(jié)果

本次實驗共檢測132個樣品，均為陰性，合格率100%，詳見表2。

表2 樣品氯霉素檢測結(jié)果

3.3 回收率檢測結(jié)果

試劑盒對水產(chǎn)品的檢測下限為0.025μg/kg，采用5倍檢測下限為加標濃度，選取一個鯉魚樣品，添加37.5μL的Spiking10μg/L，做3個平行的回收?；厥章蕶z測結(jié)果見表3。

表3 回收率檢測結(jié)果

由表3知，最低回收率84%，最高回收率89.6%，平均回收率86%，結(jié)果表明試劑盒回收率高。

4 注意事項

氯霉素酶聯(lián)免疫反應測試盒具有高回收率、高靈敏度、檢測時間短的特點，對大批量的樣品檢測非常適用。但影響其數(shù)據(jù)準確性的因素也很多，在檢測操作過程中應注意如下幾點：第一，環(huán)境溫度。檢測過程中保證環(huán)境溫度在25℃最為適宜。避免在通風口操作，防止溫度過低；也不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發(fā)。第二，加樣。加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠近微孔接近底部，并保持接觸，使液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并避免出現(xiàn)氣泡。加標準品時從低濃度到高濃度，以確保標準品曲線質(zhì)量。第三，洗滌。洗滌在ELISA中雖不是反應步驟，卻是決定實驗成功與否的關鍵。洗滌如不徹底，特別在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異吸附，將使空白值升高。而且洗滌時最容易造成微孔間的交叉污染，因此，在甩板時動作要干凈利索且不要用力太猛，以防液體飛濺污染，最后一次甩板后在吸水紙上把液體拍干時，板要垂直，用力不可太猛。第四，時間。孵育時間的計算越規(guī)范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品，后添加樣品。

5 分析評價

本次對山西省69個水產(chǎn)養(yǎng)殖場的132份水產(chǎn)品進行了氯霉素藥物殘留檢測，所有樣品均為陰性，未出現(xiàn)不合格樣品，表明養(yǎng)殖過程中未添加氯霉素。

水產(chǎn)品質(zhì)量安全管理工作是一個長期、復雜、艱巨的社會系統(tǒng)工程，山西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全起步較晚，雖然近幾年取得了一定成效，但仍存在諸多問題。此次檢測雖未出現(xiàn)不合格樣品，但由于抽檢覆蓋率較小，尚不能全面代表全省水產(chǎn)品質(zhì)量現(xiàn)狀，今后仍應繼續(xù)加強健康養(yǎng)殖推廣力度，嚴格控制苗種來源，積極推進市場準入制度，建立較為牢固的長效監(jiān)管機制，探索建立全過程質(zhì)量安全追溯體制，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。