武 棟

（山西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，山西 太原 030002）

1 引言

氯霉素（chloramphenicol，以下簡(jiǎn)稱 CAP）為1947年從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomycesvenezuela）的培養(yǎng)濾液中分離出的結(jié)晶性抗菌素，是第一個(gè)采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的抗生素，是一種有效的廣譜抗生素，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，常用氯霉素治療各種傳染性疾病，但同時(shí)也帶來(lái)了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問(wèn)題。研究表明，氯霉素有嚴(yán)重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性。因此，氯霉素殘留問(wèn)題已引起國(guó)際組織和世界上許多國(guó)家和地區(qū)的高度重視，歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零允許量”，即不得檢出。

從20世紀(jì)90年代起，隨著山西省水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速向高密度集約化方向發(fā)展，養(yǎng)殖水域自身污染日益加重，養(yǎng)殖病害日趨增多，濫用漁藥、化肥、飼料、飼料添加劑等漁業(yè)投入品的現(xiàn)象屢禁不止，加之工礦企業(yè)和生活排污對(duì)養(yǎng)殖水域造成一定的污染，導(dǎo)致養(yǎng)殖水產(chǎn)品品質(zhì)下降，給漁業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)造成極大損失，對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生不利影響。為此，加強(qiáng)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控已勢(shì)在必行。

水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控要以源頭治理為重點(diǎn)，嚴(yán)把漁業(yè)投入品尤其是藥物使用關(guān)，大力推進(jìn)漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；以推進(jìn)市場(chǎng)準(zhǔn)入制度和無(wú)公害水產(chǎn)品認(rèn)證為契機(jī)，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品質(zhì)量安全全程可追溯管理；依照國(guó)家法律法規(guī)和有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)水產(chǎn)品（包括產(chǎn)地環(huán)境和漁業(yè)投入品）質(zhì)量安全實(shí)施監(jiān)測(cè)檢測(cè)。下面以酶聯(lián)免疫法對(duì)全省69個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的132份水產(chǎn)品進(jìn)行氯霉素藥物殘留檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 樣品及儀器

本次共抽檢132個(gè)樣品，其中鯉魚54個(gè)、草魚49個(gè)、虹鱒魚13個(gè)、鰱魚10個(gè)、鳙魚6個(gè)，樣品取自山西省的69個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)儀器采用MK3酶標(biāo)儀，試劑采用氯霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)試盒（美國(guó)REAGEN）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品采集

每個(gè)樣品均抽取3尾魚，去鱗去皮取背部肌肉絞碎混合均勻；試樣量為400g，分為兩份，其中一份用于檢測(cè)，一份作為留樣。

2.2.2 樣品前處理

取適量樣品用組織搗碎機(jī)搗碎，稱3g搗碎樣品置50mL離心管中，加入6mL乙酸乙酯，以最大轉(zhuǎn)速旋渦振蕩3min；25℃下離心力4000g、離心5min；移取4mL乙酸乙酯上清液至玻璃管中，在60℃～70℃水浴氮?dú)獯蹈桑辉诓Ａг嚬苤屑尤?mL正己烷完全溶解干燥物，再加入1mL單倍SampleEstractionBuffer，旋渦振蕩2min；25℃下離心力4000g、離心10min，去除上層正己烷層，下層液作為樣品液備用。

2.2.3 檢測(cè)步驟

取100μL的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液于所設(shè)定的孔中，在每孔中加入50μLCAP-HRPConjugate，輕敲微孔板邊緣混勻30s，25℃避光孵育1h。將微孔中液體甩掉，每孔加入250μL單倍WashSolution洗板，重復(fù)3次，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上拍干。每孔加入 100μL的 TMBSubstrate，25℃避光孵育 15～20min，加入 100μL的 StopBuffer，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以相對(duì)吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見表1。據(jù)圖1得出，相關(guān)系數(shù)為0.9913。

表1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 樣品檢測(cè)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)132個(gè)樣品，均為陰性，合格率100%，詳見表2。

表2 樣品氯霉素檢測(cè)結(jié)果

3.3 回收率檢測(cè)結(jié)果

試劑盒對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)下限為0.025μg/kg，采用5倍檢測(cè)下限為加標(biāo)濃度，選取一個(gè)鯉魚樣品，添加37.5μL的Spiking10μg/L，做3個(gè)平行的回收?；厥章蕶z測(cè)結(jié)果見表3。

表3 回收率檢測(cè)結(jié)果

由表3知，最低回收率84%，最高回收率89.6%，平均回收率86%，結(jié)果表明試劑盒回收率高。

4 注意事項(xiàng)

氯霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)試盒具有高回收率、高靈敏度、檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn)，對(duì)大批量的樣品檢測(cè)非常適用。但影響其數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的因素也很多，在檢測(cè)操作過(guò)程中應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：第一，環(huán)境溫度。檢測(cè)過(guò)程中保證環(huán)境溫度在25℃最為適宜。避免在通風(fēng)口操作，防止溫度過(guò)低；也不要在陽(yáng)光直射下實(shí)驗(yàn)，防止過(guò)熱及蒸發(fā)。第二，加樣。加入樣品或者試劑到空的微孔板時(shí)，吸嘴靠近微孔接近底部，并保持接觸，使液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并避免出現(xiàn)氣泡。加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)從低濃度到高濃度，以確保標(biāo)準(zhǔn)品曲線質(zhì)量。第三，洗滌。洗滌在ELISA中雖不是反應(yīng)步驟，卻是決定實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。洗滌如不徹底，特別在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異吸附，將使空白值升高。而且洗滌時(shí)最容易造成微孔間的交叉污染，因此，在甩板時(shí)動(dòng)作要干凈利索且不要用力太猛，以防液體飛濺污染，最后一次甩板后在吸水紙上把液體拍干時(shí)，板要垂直，用力不可太猛。第四，時(shí)間。孵育時(shí)間的計(jì)算越規(guī)范越好，保持添加標(biāo)準(zhǔn)品的一致性，先添加標(biāo)準(zhǔn)品，后添加樣品。

5 分析評(píng)價(jià)

本次對(duì)山西省69個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的132份水產(chǎn)品進(jìn)行了氯霉素藥物殘留檢測(cè)，所有樣品均為陰性，未出現(xiàn)不合格樣品，表明養(yǎng)殖過(guò)程中未添加氯霉素。

水產(chǎn)品質(zhì)量安全管理工作是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜、艱巨的社會(huì)系統(tǒng)工程，山西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全起步較晚，雖然近幾年取得了一定成效，但仍存在諸多問(wèn)題。此次檢測(cè)雖未出現(xiàn)不合格樣品，但由于抽檢覆蓋率較小，尚不能全面代表全省水產(chǎn)品質(zhì)量現(xiàn)狀，今后仍應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)健康養(yǎng)殖推廣力度，嚴(yán)格控制苗種來(lái)源，積極推進(jìn)市場(chǎng)準(zhǔn)入制度，建立較為牢固的長(zhǎng)效監(jiān)管機(jī)制，探索建立全過(guò)程質(zhì)量安全追溯體制，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。