呂 濤，李延倉，李樹仁，牛希華，婁季鶴

(鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科，河南鄭州450004)

依達拉奉對脂多糖引起的小鼠急性肺損傷的保護效應研究

呂 濤，李延倉，李樹仁，牛希華，婁季鶴

(鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科，河南鄭州450004)

［目的］探討依達拉奉在急性肺損傷當中的保護效應及其可能的機制。［方法］成年C57小鼠54只被隨機等分為3組:正常組(假手術組)，對照組(LPS+生理鹽水)和實驗組(LPS+依達拉奉)。將對照組和實驗組小鼠，采用氣道內(nèi)注入LPS溶液(2 mg/mL)1 mL/kg造急性肺損傷模型，正常組小鼠不注。實驗組小鼠尾靜脈注射依達拉奉溶液(2 mg/mL)2.5 mL/kg，對照組小鼠注射等體積生理鹽水。24 h后，每組取6只小鼠腹腔注射過量麻醉戊巴比妥(100 mg/kg)，后斷頭處死，取肺組織用于組織學及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、TNF-α，IL-1β和IL-6的檢測。每組余下的12只小鼠用做生存率實驗，每12 h觀測1次并記錄小鼠存活的情況，觀察周期為4 d。［結果］實驗組小鼠生存率明顯高于對照組(P＜0.05);LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的MDA含量由(1.41±0.119) nmol/mg上升到(4.48±0.159)nmol/mg，而依達拉奉治療后則降到(2.56±0.157)nmol/mg(P＜0.01);LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的SOD活力由(12.86±1.49)U/mg下降到(8.95±1.02)U/mg，而依達拉奉治療后則上升至(10.69± 1.77)U/mg(P＜0.01);同時，LPS刺激后，小鼠肺組織內(nèi)的TNF-α，IL-1β和IL-6含量分別由(47.89±4.71)pg/ mg、(79.39±3.45)pg/mg和(81.9±6.39)pg/mg上升到(300.48±12.18)pg/mg、(717.99±35.01)pg/mg和(428.99± 21.89)pg/mg，而依達拉奉治療后小鼠肺組織的含量則降到(191.84±6.43)pg/mg、(236.87±13.46)pg/mg和(136.92±12.47)pg/mg。病理結果顯示:依達拉奉減輕了LPS引起的肺水腫，彌漫性出血和炎性細胞的浸潤等癥狀。［結論］依達拉奉可以減輕LPS引起的急性肺損傷。

依達拉奉;脂多糖;急性肺損傷

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導致的急性進行性呼吸衰竭。ALI和ARDS具有性質相同的病理生理改變，ARDS是嚴重的ALI，也是目前病人死亡的主要因素之一［1］。ALI的病因各不相同，發(fā)病機制復雜，但被激活的各種細胞經(jīng)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygens pecies，ROS)引起機體氧化應激狀態(tài)的失衡，在ALI的病理生理過程中起到了重要作用，國內(nèi)外很多研究已經(jīng)證實通過外源性的抗氧化劑補給可以減輕LPS導致的ALI［1-3］。依達拉奉是目前臨床上廣泛應用的一種抗氧化劑。本研究利用氣道注射脂多糖(LPS)的方法建立小鼠的急性肺損傷模型，來探討依達拉奉對小鼠急性肺損傷的保護效應以及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

成年的健康雄性C57小鼠54只，體重20～22 g，購自鄭州大學實驗動物中心。實驗前將小鼠適應性飼養(yǎng)7 d，光照條件為白天/黑夜(12 h∶12 h)循環(huán)，任其自由進食。本實驗的所有涉及動物實驗的操作步驟均得到河南省鄭州大學動物倫理委員會同意。LPS和戊巴比妥購自美國Sigma公司。使用前，LPS用醫(yī)用生理鹽水配制成2 mg/mL母液。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β和IL-6檢測試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 實驗分組及方法

將54只小鼠隨機分為3組，每組18只。分為正常組(假手術組)，對照組(LPS+生理鹽水)及實驗組(LPS+依達拉奉)。將對照組和實驗組的小鼠用氣道注射LPS的方法造急性肺損傷模型。具體過程如下:將小鼠麻醉(腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥)后，使其平躺于恒溫動物手術臺上，鈍性分離暴露氣管，用微量注射器通過氣管穿刺的方法給小鼠氣管內(nèi)注射1 mL/kg的LPS鹽溶液，后將傷口縫合，并用碘伏對縫合區(qū)域進行消毒。實驗組傷后2 h尾靜脈注射2.5 mL/kg的依達拉奉注射(2 mg/mL)溶液，而對照組注射等體積的生理鹽水。在傷后24 h，3組各取6只小鼠，均過量麻醉(腹腔注射100 mg/kg體重的戊巴比妥)后斷頭處死，打開胸腔，分離肺臟，取左肺，用4℃預冷的生理鹽水清洗并用濾紙吸干表面液體后立即置液氮內(nèi)，并在液氮冷凍狀態(tài)下研磨成粉，儲存于-80℃冰箱中用于氧化應激和炎癥相關因子的測定;右肺固定于4%的多聚甲醛溶液中用于組織學染色。每組剩余的12只老鼠用做生存率實驗，觀察周期為傷后4 d，每12 h觀測1次，并詳細的記錄小鼠的死亡時間。

1.3 肺組織中MDA和SOD的檢測

肺組織中MDA含量和SOD活性的測定根據(jù)商業(yè)化的試劑盒說明書所述化學方法進行。具體操作如下:取凍存于-80℃中約100 mg肺組織粉末加入2 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，12000 g，4℃離心20 min，取上清作MDA和SOD的檢測。MDA水平通過與硫代巴比妥酸反應顯色的方法在酶標儀中讀取535 nm波長處的吸光度(absorbance，A)，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。SOD活性通過氮藍四唑還原法即通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)還原亞硝酸鹽，SOD活性用U/mg來表示。

1.4 肺組織中炎癥因子的測定

取凍存于-80℃中的約10 mg肺組織粉末加入0.5 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，12000 g，4℃離心20 min，取上清用酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α、IL -1β和IL-6含量，在450 nm波長處讀取A值，根據(jù)樣品標準曲線計算TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.5 肺組織病理學觀察

取出固定于4%多聚甲醛液中肺組織，脫水，石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片，行常規(guī)做HE染色，用普通光鏡觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包處理，文中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，組間參數(shù)比較采用單因素的方差分析，用Kaplan-Meier的統(tǒng)計方法來繪制統(tǒng)計圖表，同時用Log-Rank來做生存率檢驗，將P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 依達拉奉對LPS引起的小鼠生存率的影響

本研究結果顯示，實驗組的小鼠生存率明顯高于對照組，見圖1。

圖1 依達拉奉對小鼠生存率的影響Fig 1 Effect of edaravone on LPS-induced mice survival rate

2.2 依達拉奉對LPS引起的肺組織炎癥反應的影響

傷后24 h的結果顯示，實驗組IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯低于對照組。見表1。

表1 依達拉奉對傷后24 h小鼠肺組織炎癥反應的影響Tab 1 The effects of edaravone treatment on the LPS-induced inflammatory response in lung tissues at 24 h post-injury

2.3 依達拉奉對LPS刺激后肺組織SOD活力和MDA含量的影響

傷后24 h，實驗組肺組織中的MDA含量明顯低于對照組，SOD含量明顯高于對照組。見表2。

表2 依達拉奉對傷后24 h肺組織中SOD活力和MDA含量的影響Tab 2 Effects of edaravone treatment on MDA content and SOD activity in lung tissues at 24 h post-injury

2.4 依達拉奉對肺組織病理形態(tài)的影響

傷后24 h肺組織HE染色結果顯示，對照組出現(xiàn)明顯肺水腫，彌漫性出血，肺泡間隔增寬和大量炎性細胞的浸潤。而實驗組，肺損傷的情況得到明顯減輕，見圖2。

3 討 論

急性肺損傷是臨床上常見的一種疾病，可以由嚴重感染、創(chuàng)傷和休克等因素誘發(fā)，且疾病的進程較快，常發(fā)展為ARDS，進而危及患者生命［4-6］。表現(xiàn)為單核巨噬細胞等炎性細胞的浸潤和多種細胞因子及黏附分子的過度表達，即出現(xiàn)“細胞因子瀑布”，而肺實質的病變表現(xiàn)為肺水腫、中性粒細胞的浸潤、肺泡間隔的增寬同時也伴隨著肺細胞的凋亡［2］。氧化應激損傷在急性肺損傷當中發(fā)揮著重要的作用，在LPS誘導的急性肺損傷當中，由于大量炎性細胞的浸潤，導致呼吸鏈的爆發(fā)，從而導致大量的活性氧(O2-和·OH)產(chǎn)生，而大量的活性氧產(chǎn)生會導致脂質的過氧化、DNA的損傷和蛋白酶的失活進而導致細胞的凋亡［7-8］。所以抗氧化對于控制急性肺損傷的病程十分關鍵，國內(nèi)外已經(jīng)有用各種抗氧化劑，例如:維生素類、N-乙酰半胱氨酸和氫氣等來治療LPS引起的急性肺損傷的相關研究出現(xiàn)［9-10］。

圖2 依達拉奉對傷后24 h小鼠肺結構的影響(×200)Fig 2 The effects of edaravone treatment on LPS-induced lung histology changes(×200)

依達拉奉是一種新型的抗氧化劑，目前臨床上主要應用于腦中風后的患者。它的主要藥理機制是可以中和·OH和ONOO-等［11］。目前研究發(fā)現(xiàn)，依達拉奉對于燒傷、博來霉素、急性胰腺炎等引起的肺損傷都有一定的治療效果，但是對于LPS引起急性肺損傷的研究尚未見報道［12-14］。本研究建立了一個小鼠的急性肺損傷模型，來探討依達拉奉對于其治療效果的影響。

組織氧化應激的嚴重程度取決于體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的速率與組織和細胞抗氧化能力之間的平衡，組織抗氧化能力則是由各種抗氧化物和酶類自由基清除劑組成。在正常生理情況下，機體的組織和細胞內(nèi)也存在氧自由基，但它們保持在一個很低水平上發(fā)揮其生理功能。機體在組織損傷和應激過程中產(chǎn)生大量自由基，造成自身細胞和組織器官的過氧化損傷。MDA是檢測氧化應激損傷和細胞膜脂質過氧化反應程度的常用指標，本研究發(fā)現(xiàn):依達拉奉可以顯著的降低小鼠肺組織的MDA的水平，說明依達拉奉可以減輕LPS引起的細胞膜脂質過氧化反應和氧化應激損傷。細胞膜脂質過氧化反應升高和氧化應激損傷不但與氧自由基的過量產(chǎn)生有關，也與機體對氧自由基清除能力降低有關。SOD是體內(nèi)重要的酶類自由基清除劑之一，LPS刺激同時使肺組織的抗氧化能力降低，肺組織內(nèi)的SOD活性下降，本研究發(fā)現(xiàn)外源性的依達拉奉補給有助于恢復肺組織的抗氧化能力，減輕氧自由基對肺的損傷，這可能是依達拉奉減輕肺損傷的主要機理。

LPS引起的急性肺損傷的病理生理過程中，伴隨著大量炎癥因子的釋放，從而加重肺損傷。TNF-α，IL-1β和IL-6均是與急性肺損傷明顯相關的因子，研究證實，在LPS誘導的急性肺損傷中，它們的表達量均顯著的上調，本研究發(fā)現(xiàn)依達拉奉可以減少LPS刺激后TNF-α，IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，從而阻止了炎癥反應的放大效應。

LPS引起的肺損傷表現(xiàn)為肺泡間隔的增寬，肺水腫的發(fā)生，大量中性粒細胞的浸潤，本研究發(fā)現(xiàn)通過尾靜脈注射依達拉奉可以減輕LPS引起的肺組織的水腫及中性粒細胞的浸潤但是依達拉奉抑制肺損傷的機制有待于進一步明確。

依達拉奉對LPS引起的急性肺損傷的保護效應主要是通過減輕肺組織的氧化應激損傷，同時保護了體內(nèi)自身的抗氧化能力，繼而阻止了肺組織促炎性細胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放，最終減輕了肺的病理學改變并降低了小鼠的死亡率。

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Therapeutic efficacy of Edaravone for LPS-induced acute lung injury in mice

Lü Tao，LI Yan-cang，LI Shu-ren，NIU Xi-hua，LOU Ji-he
(Department of Burn and Plastic Surgery，F(xiàn)irst People＇s Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450004，China)

［Objective］To investigate the protective effects of edaravone treatment on lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI).［Methods］Fifty-four mice were randomized into 3 groups:normal group(Sham operation)，control group(LPS+physiological saline)and experiment group(LPS+Edaravone).The mice in control and experiment group were induced ALI by intra-tracheal LPS solution(2 mg/kg body weight).The mice in experiment group were given Edaravone solution(2 mg/mL)2.5 mL/kg body weight and the mice in control group were given saline at the same volume.At 24 h post-injury，6 mice in each group were killed and their lung tissues were isolated and assayed for malonaldehyde (MDA)，superoxide dismutase activity(SOD)，TNF-α，IL-1β，IL-6 and histological examination.The remained 12 mice in each group were used for monitoring the survival rate of mice every 12 h for 4 days.［Results］Our experiments exhibited that the survival rate of experiment group was higher than control group(P＜0.05).After LPS stimula-tion，MDA content in the lung tissues was increased from(1.41±0.119)nmol/mg to(4.48±0.159)nmol/mg，whereas it was decreased to(2.56±0.157)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，SOD activity in the lung tissues was decreased from(12.86±1.49)U/mg to(8.95±1.02)U/mg，whereas it was increased to(8.95 ±1.02)nmol/mg in the Edaravone treatment group(P＜0.01).After LPS stimulation，TNF-α，IL-1β and IL-6 content in the lung tissues was increased from(47.89±4.71)pg/mg，(79.39±3.45)pg/mg and(81.9±6.39)pg/mg to(300.48±12.18)pg/mg，(717.99±35.01)pg/mg and(428.99±21.89)pg/mg，whereas they were decreased to(191.84±6.43)pg/ mg，(236.87±13.46)pg/mg and(136.92±12.47)pg/mg in the Edaravone treatment group.Edaravone treatment further attenuated lung edema，inflammatory cell infiltrations，widened alveolar septum，and diffuse hemorrhage.［Conclusions］In conclusion，our data demonstrated that ameliorated LPS-induced ALI.

Edaravone;lipopolysaccharide;acute lung injury

R641

A

1671-7295(2012)04-0343-05

2011-12-07;

2012-06-29

呂濤(1970-)，男，河南鄭州人，副主任醫(yī)師。E-mail:lvtao8977@163.com