紀 軍，張 利，桑麗敏，林海龍，何學(xué)志，吳園園，顏培實，孫喜琢

(大連市中心醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連116033)

成人自體心肌干細胞體外高效擴增及特異性鑒定

紀 軍，張 利，桑麗敏，林海龍，何學(xué)志，吳園園，顏培實，孫喜琢

(大連市中心醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連116033)

［目的］建立一種穩(wěn)定、高效的成人自體心肌干細胞體外培養(yǎng)擴增及特異性鑒定方法。［方法］手術(shù)中取下的心臟組織標本，通過膠原酶消化的方法獲得細胞，使用自體血清進行貼壁培養(yǎng)和傳代的方法純化細胞，細胞增殖至3代后進行RT-PCR基因表達檢測，流式細胞表面標記檢測及染色體核型分析的鑒定。［結(jié)果］通過本實驗的方法可以在成人心肌組織中分離和純化心肌干細胞，并在體外可大量增殖，至3代細胞可增殖至5×107。RT-PCR鑒定其具有全能干細胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的mRNA表達，及心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的mRNA和蛋白表達;表達間質(zhì)干細胞表面標記CD29、CD90、CD105;不表達造血干細胞表面標記CD45和人免疫抗原HLA-DR;且培養(yǎng)后46條染色體無移位和缺失等染色體突變。［結(jié)論］通過本研究確立了一種穩(wěn)定、高效的成人自體心肌干細胞體外培養(yǎng)，擴增和特異性鑒定的方法，為自體心肌干細胞移植技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定重要的基礎(chǔ)。

自體組織;心肌干細胞;基因表達;流式細胞術(shù);核型分析

傳統(tǒng)觀點認為心臟是高度分化器官，沒有再生能力;心肌細胞是終末分化細胞，是不可再生的細胞。胎兒出生后的心肌細胞已永久性的退出細胞周期，在心肌損傷后不能自我更新和修復(fù)壞死心肌，心臟只能通過心肌細胞肥大來適應(yīng)心臟負荷的增加，心肌受損后心肌組織被瘢痕組織取代，最終導(dǎo)致心臟收縮功能的不可逆損傷。然而近幾年來的動物實驗和臨床實驗證實，無論是在生理還是病理的情況下，心肌細胞均在不斷的更新，但更新的比例極低，包括人類在內(nèi)的成體哺乳動物心臟組織中具有特異性心肌分化潛能的原始多能干細胞，即成體心肌干細胞(cardiac stem cells，CSCs)［1-3］，這些研究為干細胞治療缺血性心臟病帶來了希望。

但是，CSCs的研究仍處于基礎(chǔ)實驗研究階段，CSCs的分離提取，培養(yǎng)擴增，及純化等也缺乏重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的實驗方法;且僅靠個別單一細胞表面抗原表達鑒定，手段單一，缺乏有效性和可靠性。干細胞研究的終極目標是臨床上的細胞移植治療，要達到這樣的高度，干細胞的培養(yǎng)必須滿足穩(wěn)定、無污染、長期培養(yǎng)后維持其基因表達的特異性和染色體保持穩(wěn)定狀態(tài)這些先決條件。本研究通過成人心肌標本的培養(yǎng)試圖建立一種穩(wěn)定、高效的方法來獲取和鑒定CSCs，為CSCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供有力的實驗方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

D-PBS、TrypLETM、DMEM/F12均購自GIBCO公司，collagenaseⅡ、rh-bFGF購自Invitrogen公司，RT-PCR引物及試劑盒購自大連寶生物公司，抗人CD29、CD90、CD105、CD45、Stro-1和HLA-DR等流式抗體購自Backman Coulter公司，Nkx2.5及GATA4 Western blot抗體購自Abcam公司，40 μm及70 μm濾器等實驗耗材均購自BD公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞提取分離:心臟組織標本(心臟瓣膜移植手術(shù)中取下的瓣膜邊緣心肌組織，約20～30 mg)無菌操作下置于培養(yǎng)皿中，滴加0.4%Ⅱ型膠原酶，將組織剪碎成0.5 mm3左右的小塊。剪碎組織置于20 mL膠原酶中，37℃空氣恒溫震蕩30 min，靜置5 min。取上清，與20 mL DMEM/F12混合，經(jīng)70 μm及40 μm濾器過濾，4℃保存;沉淀置于另20 mL膠原酶中，重復(fù)上步。兩支同時4℃，1500 r/min，離心5 min。棄上清，沉淀30 mL DMEM/F12洗1次;1 mL DMEM/F12重懸，苔盼蘭染色計數(shù)。

1.2.2 細胞培養(yǎng):提取細胞接種于培養(yǎng)皿，使用DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%自體血清，添加0.4 μg/ mL的rh-bFGF。視細胞生長情況每3～4 d進行換液，換液時D-PBS洗2遍，加入DMEM/F12培養(yǎng)基并補充適量rh-bFGF。每8～10 d細胞達到80%融合時進行傳代。傳代時使用TrypLETM完全消化約10 min，等量DMEM/F12終止消化，1500 r/min，離心5 min，細胞DMEM/F12重懸，計數(shù)，適量細胞數(shù)傳代。

1.2.3 細胞mRNA表達鑒定:收集第3代2×106細胞，提取總mRNA，紫外分光光度計定量。采用一步法RT-PCR進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴增。檢測干細胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1和心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4的mRNA表達，以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件:94℃，2 min;94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，1 min(35個循環(huán));72℃，5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像及分析軟件系統(tǒng)記錄和分析mRNA表達結(jié)果。

1.2.4 Nkx2.5和GATA4的蛋白表達檢測:收集第3代2×106細胞，提取總蛋白，紫外分光光度計定量。待檢測蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。在含5 g/L脫脂奶粉(w/v)的PBS(加tween-20)中4℃封閉過夜。分別加入1∶800稀釋的心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的多克隆一抗，室溫孵育2 h以上，加二抗及顯色劑。使用ECL-Plus Detection System檢測免疫復(fù)合物，蛋白產(chǎn)物分別為72 kDa及44 kDa，β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞表面標記:收集第3代5×106細胞，D-PBS洗2遍，取20～50 μL的抗人CD29、CD90、CD105、CD45、Stro-1和HLA-DR抗體與細胞充分混勻，4℃避光孵育20 min，用流式清洗液洗滌2次，加適量固定液固定后用于流式細胞儀表面標記檢測。流式檢測所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.2.6 染色體核型分析:第2代CSCs傳代至培養(yǎng)瓶中，視細胞貼壁生長和有絲分裂情況適時加入秋水仙素(終濃度0.05 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將細胞刮離瓶底，2000 r/min，離心15 min。去上清，低滲液37℃處理5 min，固定液固定2次，50℃烤片過夜。0.025%胰酶消化30 s，吉姆薩染色后閱片，每片計數(shù)50個分裂中期相，分析10個核型。采用美國Video Test-Karyo軟件進行染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1 CSCs細胞生長及增殖情況

從成人心肌組織中消化所得的懸浮細胞，呈圓形，單核，大小較均一。接種后一般經(jīng)過24～36 h少數(shù)細胞開始貼壁;換液后不貼壁圓形懸浮細胞基本全部清除;培養(yǎng)7 d使用相差顯微鏡觀察，貼壁細胞增殖明顯，形態(tài)各異;傳代后細胞增殖速度明顯加快;至第3代細胞成梭形，排列較規(guī)律，具有類似心肌細胞形態(tài)，細胞數(shù)達到5×107以上。細胞生長狀態(tài)如圖1所示。

圖1 CSCs細胞培養(yǎng)和生長情況Fig 1 Cell culture and cell growth state pictures of CSCs

2.2 CSCs基因表達及蛋白表達鑒定結(jié)果

培養(yǎng)至3代的細胞仍然表達4項多能干細胞未分化因子:Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1;并且表達具有早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和、GATA4的mRNA和蛋白表達(圖2、3)。證實培養(yǎng)細胞為具有多項分化潛能的原始心肌干細胞。

圖2 CSCs細胞RT-PCR基因表達鑒定結(jié)果Fig 2 RT-PCR gene expression identification of CSCs

圖3 CSCs細胞Nkx2.5和GATA4的蛋白表達Fig 3 Nkx2.5 and GATA4 protein expression of CSCs

2.3 CSCs表面標記鑒定結(jié)果

培養(yǎng)至3代的細胞表達間質(zhì)干細胞表面標記CD29(99.9%)和CD105(100%)，部分表達間質(zhì)干細胞表面標記CD90(36.4%)和Stro-1(3.5%);造血干細胞表面標記CD45表達僅占3.3%;且不表達人免疫抗原HLA-DR(0.0%)(圖4)。

2.4 CSCs染色體核型分析

使用Video Test-Karyo軟件進行染色體核型分析結(jié)果顯示:經(jīng)過3代，28 d的體外培養(yǎng)后，細胞46條染色體核型全部正常，未發(fā)現(xiàn)缺失或移位等染色體突變現(xiàn)象(圖5)。

圖4 流式CSCs細胞表面標記鑒定結(jié)果Fig 4 CSCs cell surface antigen identified of FACS

圖5 CSCs染色體核型分析結(jié)果Fig 5 Karyotype analysis of CSCs

3 討論

一般認為，成體哺乳動物的心肌細胞已永久地退出細胞周期，在心肌損傷后不能自我更新和修復(fù)壞死心肌。但是，最近的研究表明，成體心臟中可能保留著早期胚胎發(fā)育的多能CSCs。心臟組織損傷后，如心肌梗塞［4-5］，心肌細胞可以再生。目前多數(shù)學(xué)者認為CSCs是指一種細胞膜上能夠表達一種或多種干細胞相關(guān)抗原多能干細胞表面標志的未分化細胞，如干細胞因子受體(c-kit)，P糖蛋白(MDR)和干細胞抗原(Sca-1)等多能干細胞的表面標志。而且這些細胞在一定條件下，能夠分化為心肌組織中的各種細胞的未分化細胞［6］。

2003年Oh等［7］進行了心肌細胞的首次分離，他們將小鼠心臟取出后以膠原酶灌注和消化，消化后的細胞采用磁珠法分離出Sca-1+的心肌干細胞。然而，對于心肌干細胞磁珠分選及鑒定的表面標記各研究的報道并不一致。Wang等［8］證實鼠心臟分離得到的Sca-1+/CD31-細胞體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)表達內(nèi)皮細胞及心肌細胞標志。但是，如果無誘導(dǎo)分化因子(例如DKK-1、DMSO、BMP2、FGF4、FGF8、5 -azacytidine)的存在，Sca-1+心肌干細胞定向分化成心肌細胞的陽性率是很低的。Laugwitz等［9］證實新生小鼠心臟中存在Isl1+細胞，這些細胞不表達Sca-1、CD31及c-kit，將其與新生心肌細胞共同培養(yǎng)可分化為成熟心肌細胞。在利用譜系追蹤技術(shù)對Isl1+細胞分化研究顯示其能夠分化為血管內(nèi)皮、心內(nèi)膜、平滑肌、傳導(dǎo)系統(tǒng)、右室及左房肌細胞譜系。雖然在新生個體心肌中Isl1+細胞普遍存在，但其在成體哺乳動物的心臟中存在較少，目前僅在右心房中發(fā)現(xiàn)，生理功能不詳。Dawn等［10］則認為從人心肌組織中分離得到的c-kit+細胞為心肌干細胞。事實上，小鼠、大鼠、狗和人心臟的實驗定量數(shù)據(jù)表明在30000～40000個心肌細胞中有1個CSC，大約65%的所有CSCs共同表達3種干細胞抗原(c-kit、MDR1、Sca-1)，20%的為兩種抗原，15%為一種抗原。大概5%的細胞不表達c-kit、MDR1、Sca-1。這些表面抗原標記物的分布的不同，是否與細胞的功能不同有關(guān)也不清楚［11-12］。

心肌的修復(fù)要求心肌細胞和冠狀血管的形成，它不可能單單通過分化成心肌就完成修復(fù)。因為心肌梗死發(fā)生后，心肌細胞的發(fā)生并不能使運動功能缺失的區(qū)域恢復(fù)收縮功能，心肌細胞也不能在缺血的條件下生長存活。同樣，血管的單獨產(chǎn)生不能恢復(fù)和重建梗死區(qū)心肌的收縮能力，血管不能帶來心臟的動力，心肌重生必須利用多種表型的CSCs的協(xié)同作用。因此，依靠個別單一干細胞抗原進行磁珠分選來獲取及鑒定CSCs的方法不僅效率低下，具有多種不確定性，同時也不利于得到多種分化潛能的CSCs。

當(dāng)然，作為多能干細胞的CSCs也表達部分胚胎干細胞(ES)的標志物Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1。它們在全能胚胎干細胞和生殖細胞上表達，該表達對于維持干細胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化可導(dǎo)致這些標志物mRNA表達的下調(diào)。它們不僅是細胞系多能分化的主要調(diào)節(jié)因子，而且也是主要的作為鑒定全能ES細胞的標志物［13］。CSCs也表達間質(zhì)干細胞表面標記CD29、CD105、CD90和Stro-1等，但不表達造血干細胞表面標記CD45和人免疫抗原HLA-DR［14-15］。CSCs除表達多能干細胞的某些表面標志外，同時已開始表達早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子，如Nkx2.5、肌細胞促進因子-C(MEF-C)和GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)等［16-17］。這些心肌形成轉(zhuǎn)錄因子的表達是CSCs分化發(fā)育的先決條件。早期心肌形成轉(zhuǎn)錄因子的表達受心肌微環(huán)境內(nèi)多種誘導(dǎo)因素如生長因子和激素等的調(diào)控。在CSCs定位到損傷心肌后，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、BMP2和Cripto-1等與CSC表面受體結(jié)合，激活干細胞內(nèi)Smads、TAK1和PI3K等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)小分子，繼而誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2)、GATA4、Nkx2.5和MEF-C等轉(zhuǎn)錄因子的表達，啟動CSC的終末分化。Nkx2.5是CSCs內(nèi)最早表達的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)控CSC內(nèi)MLC-v和ANP等終末心肌分化基因的表達［18］。GATA4是具有雙重鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控α-MHC、ANP和MLC等多種終末心肌分化基因的表達［19］。干細胞內(nèi)終末心肌分化基因的表達需要轉(zhuǎn)錄因子間的相互協(xié)同。總之，多種干細胞表面標記，全能干細胞標志物，以及早期心肌固有轉(zhuǎn)錄因子的表達檢測是鑒定具有多種分化潛能心肌干細胞的重要前提。

本實驗通過膠原酶消化的方法從成人心肌組織中獲得單個細胞，不采用個別單一干細胞抗原磁珠分選的方法，而是通過使用自體血清貼壁培養(yǎng)和傳代對細胞進行純化和擴增，大大提高了擴增效率，至3代細胞可增殖至5×107以上，并且在10代后仍然保持旺盛的增殖能力。培養(yǎng)3代后的細胞不僅保持全能干細胞因子Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1的表達，并且具有心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4的mRNA和蛋白表達;同時表達間質(zhì)干細胞表面標記CD29、CD90、CD105(本實驗Stro-1呈低表達)，但不表達造血干細胞表面標記CD45和人免疫抗原HLA-DR;且經(jīng)過28 d體外培養(yǎng)后，染色體核型未發(fā)生缺失、移位等突變。這些實驗結(jié)果證實，本實驗的方法可以穩(wěn)定、高效的獲取和全面、可靠的鑒定具有多向分化功能的CSCs，為CSCs的基礎(chǔ)研究和成人自體CSCs移植技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定重要的基礎(chǔ)。

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Autologous adult cardiac stem cells amplification efficiency and specific identification in vitro

JI Jun，ZHANG Li，SANG Li-min，LIN Hai-long，HE Xue-zhi，WU Yuan-yuan，YAN Pei-shi，SUN Xi-zhuo
(Department of Central Laboratory，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian 116033，China)

［Objective］To establish a stable and efficient adult cardiac stem cells in vitro amplification and identification methods.［Methods］Heart tissue removed in surgery，the cells obtained by collagenase digestion method，using the adherent culture purified cells and passage.Cell proliferation to third-generation，gene expression detected by RT-PCR;cell surface markers detected by flow cytometry;and the karyotype identification analysised by karyotyping.［Results］Through this experiment，the cardiac stem cells in adult cardiac tissue were isolated and purified in vitro.Cells after culture maintained pluripotent stem cell factor Nanog，Oct-4，Sox-2 and Rex-1 mRNA expression，and cardiac transcription factor Nkx2.5 and GATA4 mRNA and protein expression;expressed CD29，CD90，CD105 stem cell surface marker，but not expressed the hematopoietic stem cell surface markers CD45 and human antigens HLA-DR;and chromosome mutation did not occur.［Conclusion］Through this study，establish a stable，efficient autologous adult cardiac stem cells amplification and specific identification method in vitro.And establish an important foundation of autologous cardiac stem cell transplantation for clinical application.

autologous tissue;cardiac stem cell;gene expression;flow cytometry;karyotyping

R541

A

1671-7295(2012)04-0329-06

2012-04-13;

2012-07-01

紀軍(1976-)，男，遼寧大連人，主治醫(yī)師。E-mail:cancer-1976@hotmail.com

張利，主任醫(yī)師。E-mail:tyouri19652004@yahoo.com.cn