段曦 魏佑營(yíng) 曹克友 邱紅 魏秉培 王軍偉 吳靜 魏星

摘要：以辣椒(Capsicum annuum L.)CMS三系的不育系、恢復(fù)系與相應(yīng)雜交一代種幼苗為材料，研究了辣椒幼苗葉片對(duì)低溫弱光及其恢復(fù)過(guò)程的響應(yīng)。結(jié)果表明：隨著低溫弱光處理時(shí)間的增加，辣椒幼苗葉片的SOD活性先降低，又升高，隨后降低；POD與APX活性先升高后降低。在常溫恢復(fù)階段SOD與APX活性先降低又升高；就POD活性來(lái)說(shuō)，雜交一代種F1逐漸升高，不育系與恢復(fù)系呈現(xiàn)“V”字形變化趨勢(shì)。在低溫弱光處理階段，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pr與可溶性糖先降低后升高；脯氨酸含量與之相反。在常溫恢復(fù)階段Pr呈現(xiàn)出一直降低的趨勢(shì)；可溶性糖含量先降低隨后升高；脯氨酸含量先升高又降低。F1的SOD活性、POD活性、Pr含量高于A、R；R、F1的APX活性與可溶性糖含量高于A。恢復(fù)系與雜交種的各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于不育系。

關(guān)鍵詞： 辣椒幼苗；“三系”；低溫弱光；抗氧化酶活性；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S641.3；S129 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.003

Effect of Low Temperature and Weak Light on Anti-oxidative Enzyme Activities and Contents of Osmotic Adjustment Substances in CMS Three-lines Hot Pepper Seedlings

DUAN Xi1,2, WEI You-ying1,2, CAO Ke-you3, QIU Hong4, WEI Bing-pei1,2, WANG Jun-wei4, WU Jing1,2, WEI Xing1,2

(1.State Key Laboratory of Crop Biology of Shandong Agriculture University，Colleye of Horticulture of Shandong Agriculture University，Taian, Shandong 271018，China;2. Colleye of Horticulture of Shandong Agriculture University，Taian, Shandong 271018，China; 3.Shandong Huasheng Agriculture Limited Liability Company, Weifang, Shandong 262500,China; 4.Shandong Shidanli Fertilizer Limited Liability Company ,Linyi, Shandong 276700,China )

Ａｂｓｔｒａｃｔ: With the CMS line，Restorer line and the correspondinghybrid ofthe hot pepper (Capsicum annuum L.) seedlings as the material, the response of the hot pepper seedling leaf to weak light of low temperature and its resume stage was studied. The results showed: Only as the increase of dealing time with the low temperature and weak light, SOD activity in the seedling leaves of the hot pepper declined, afterward increased, and then declined again; POD and APX activity first increased and then decreased. During the resume stage under normal temperature, SOD and APX activity first declined and then increased; as to the activity of POD, hybrid F1 increased gradually, the CMS line and restorer line showed changing trend in the shape of "V". During the stage of low temperatures and poor light, osmotic adjustment substances like Pr and soluble sugar first decreased and then increased, the content of proline showed reverse rule. During the resume stage under normal temperature, content of Pr declined all through; soluble sugar content first decreased and then increased; proline first increased and then decreased. The SOD ，POD activity and Pr content ofhybrid was higher than A，R; The APX activity and content of soluble sugar of R、F1 was higher than A. All indexes of the hybrid and restorer line were superior to CMS line.

Key words: hot pepper seedlings；“Three-lines”；chilling under low light；anti-oxidative enzyme activities；osmotic adjustment substances

辣椒(Capsicum annuum L.)是中國(guó)冬春季設(shè)施栽培的主要蔬菜，栽培期間經(jīng)常遭受不同程度的低溫弱光脅迫，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)、光合作用、碳和氮代謝、酶活性和干物質(zhì)積累產(chǎn)生不同程度的影響 [1]，進(jìn)行低溫弱光處理及恢復(fù)過(guò)程對(duì)辣椒影響的研究，具有重要的意義 。有關(guān)低溫弱光脅迫后恢復(fù)過(guò)程對(duì)辣椒生理生化指標(biāo)影響的報(bào)道很少，大量研究均集中于短期極端低溫及中、高光強(qiáng)下低溫對(duì)辣椒抗氧化酶系統(tǒng)的影響 [2-3]。本試驗(yàn)研究了低溫弱光處理與恢復(fù)過(guò)程對(duì)CMS三系辣椒幼苗抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，旨在探討低溫弱光脅迫與恢復(fù)過(guò)程辣椒幼苗抗氧化酶系統(tǒng)在防御活性氧對(duì)細(xì)胞傷害中的作用，明確滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)辣椒低溫弱光脅迫及恢復(fù)過(guò)程產(chǎn)生的影響，研究不育系、恢復(fù)系與雜交種之間耐低溫弱光性的關(guān)系，為辣椒等蔬菜作物的栽培與抗逆育種提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1．1材料和處理

試驗(yàn)材料為經(jīng)多代自交選育的辣椒CMS三系中的不育系（A）、恢復(fù)系（R）和相應(yīng)雜交一代種（F1），試驗(yàn)用種子由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院辣椒育種課題組提供。于2007年5月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)站溫室內(nèi)播種育苗，育苗基質(zhì)為體積各占1/3的園土、有機(jī)肥和蔬菜專用育苗基質(zhì)，育苗期間按常規(guī)管理。待辣椒幼苗長(zhǎng)至6片真葉時(shí)放入RZX型人工智能氣候箱(寧波江南儀器制造廠制造)進(jìn)行抗冷指數(shù)測(cè)定試驗(yàn)。先于晝夜溫度15 ℃／10 ℃環(huán)境下預(yù)處理1 d，再置于2 ℃下處理3 d，觀察其受害癥狀，計(jì)算抗冷指數(shù)。同一批待辣椒幼苗長(zhǎng)至8～9片真葉時(shí)放入RZX型人工智能氣候箱(寧波江南儀器制造廠制造)進(jìn)行處理。試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理：處理I(CK)，光照培養(yǎng)箱中光強(qiáng)400 μmol·m-2·s-1，27 ℃/18 ℃培養(yǎng)；處理Ⅱ(T1)，光照培養(yǎng)箱光強(qiáng)30 μmol·m-2·s-1，10 ℃／5 ℃處理；各處理光周期均為12 h／12 h，空氣相對(duì)濕度保持在75%～80% ，土壤濕度與對(duì)照一致。處理10 d后，處理Ⅱ植株均移入處理I的光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)6 d，每處理12株，3次重復(fù)。分別于處理前低溫弱光處理1，5，10 d，恢復(fù)處理3，6 d，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2測(cè)定方法

抗氧化酶活性的測(cè)定：稱取0.5 g葉片鮮樣，用pH 值7.8、0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液冰浴研磨，勻漿于0～4 ℃ ，10 500 r·min-1離心15 min，上清液供SOD、POD、APX活性與Pr含量的測(cè)定。超氧物歧化酶(SOD)活性采用抑制NBT光還原比色法測(cè)定（趙世杰等 1998）；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性采用Dalton等的提取及測(cè)定方法測(cè)定 [4]；過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化比色法測(cè)定 [5]；蛋白質(zhì)(Pr)含量采用G-250方法測(cè)定 [6-7]。脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮比色法測(cè)定 [6-7]；可溶性糖采用蒽酮比色法 [6-7] 。

2結(jié)果與分析

2.1 低溫弱光脅迫及恢復(fù)過(guò)程對(duì)辣椒幼苗SOD活性的影響

低溫弱光脅迫下，SOD活性總的變化趨勢(shì)是先降低再升高，然后又降低；常溫恢復(fù)階段SOD活性先降低又升高（圖1）。雜交種（F1）一直保持著較高的SOD活性，高于不育系(A)與恢復(fù)系（R），低溫弱光處理 1 d時(shí)各材料出現(xiàn)不同程度的降低，A, F1,R分別為原來(lái)的85.5%，85.2%，75.4%；隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，從第5天開(kāi)始各品種SOD活性均降低，第10天時(shí)SOD活性A＞F1＞R。當(dāng)恢復(fù)3 d時(shí)，各材料SOD活性降到最低，隨后SOD活性開(kāi)始逐漸恢復(fù)。因此低溫弱光的解除并沒(méi)有使傷害得到立即的解除，脅迫對(duì)活性氧代謝系統(tǒng)產(chǎn)生了較大的影響，活性氧大量積累，破壞了膜結(jié)構(gòu)，使植物在恢復(fù)過(guò)程中遭受了一定的傷害。在恢復(fù)過(guò)程中，葉片中SOD活性均可恢復(fù)甚至超出對(duì)照水平，其中雜交種F1得到了較快的恢復(fù)。綜合比較雜交種維持了較高的SOD水平，具有較大的活性氧清除能力。

2.2低溫弱光脅迫及恢復(fù)過(guò)程對(duì)辣椒幼苗POD與APX活性的影響

由圖2可知，低溫弱光脅迫下POD活性呈現(xiàn)出先升高再降低的變化趨勢(shì)；常溫恢復(fù)階段雜交種F1呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，不育系A(chǔ)與恢復(fù)系R呈現(xiàn)出“V”字形變化趨勢(shì)。F1在處理1 d時(shí)POD活性達(dá)到最大，POD活性是處理前的3倍，然后呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，一直到脅迫結(jié)束。不育系(A)與恢復(fù)系（R）在處理第5天達(dá)到最大值，活性大小分別是處理前的1.75倍和1.77倍。整個(gè)處理過(guò)程中恢復(fù)系R活性保持較穩(wěn)定?；謴?fù)6 d結(jié)束時(shí)，雜交種的POD活性高于不育系與恢復(fù)系?？购贩N的POD活性高于不抗寒品種，較高的POD活性，清除自由基的能力較強(qiáng)，抵御低溫弱光傷害的能力較強(qiáng)，因此F1優(yōu)于A與R。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)清除H2O2，維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，但APX與H2O2的親和力較弱。處理過(guò)程中APX活性與POD活性具有相似的變化規(guī)律(圖3)。在低溫弱光處理與恢復(fù)階段各材料總的變化趨勢(shì)是先升高，然后降低，最后升高，只是各處理材料出現(xiàn)極值的時(shí)間不一致。在處理第1天時(shí)恢復(fù)系（R）達(dá)到最大值，為處理前的3.14倍；在處理第5天，不育系(A)達(dá)到最大值，為處理前的1.3倍；第10天，雜交種F達(dá)到極值，為處理前的3倍?？傮w從APX活性來(lái)看，R優(yōu)于F1，F(xiàn)1優(yōu)于A。

2.3低溫弱光脅迫及恢復(fù)過(guò)程對(duì)辣椒幼苗Pr與可溶性糖含量的影響

植物對(duì)逆境反應(yīng)的結(jié)果，必然會(huì)在蛋白質(zhì)含量和組成上有所體現(xiàn)，表明植物對(duì)逆境的抵抗和耐受能力，低溫弱光對(duì)Pr的含量水平帶來(lái)了一定的影響?？扇苄缘鞍缀靠偟淖兓厔?shì)是先降低又升高，然后又出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，各處理材料表現(xiàn)出相似的規(guī)律。在處理第一天蛋白質(zhì)含量略有下降，隨后出現(xiàn)含量上升的趨勢(shì)，到處理第10天達(dá)到最大值，A, F1,R分別為處理前的1.16，1.63，1.36倍。在恢復(fù)處理階段，F(xiàn)含量呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，A與R呈現(xiàn)先上升又下降的趨勢(shì)。低溫弱光影響蛋白質(zhì)含量增加表明有新的蛋白質(zhì)合成，由圖4可知，F(xiàn)中蛋白質(zhì)含量高于A，R ，表明其適應(yīng)能力明顯高于A，R。

植物在受到逆境傷害的時(shí)候，自身會(huì)產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)適應(yīng)逆境，物質(zhì)含量高低與快慢均可反映植物本身對(duì)逆境的適應(yīng)能力。由圖5可知，低溫脅迫時(shí)可溶性糖含量先降低再升高，恢復(fù)階段也呈現(xiàn)以上的趨勢(shì)。R在第5天時(shí)達(dá)到最大值，A, F1在第10天達(dá)到極值，分別是處理前的3.86，4.37，5倍，可溶性糖含量R＞F1＞A。R,F在低溫弱光處理結(jié)束以及恢復(fù)6天后仍保持較高的含量，這說(shuō)明R與F1抗冷性高于A。

2.4強(qiáng)光對(duì)低溫弱光脅迫后辣椒幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸在植物抗冷中發(fā)揮著重要的作用，低溫弱光處理階段脯氨酸含量先升高后降低，在恢復(fù)階段趨勢(shì)一樣（圖6）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量逐漸降低，A與R均保持了較高的脯氨酸含量。在低溫弱光處理1 d時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，A、F1、R含量分別為處理前的2.67，1.45，1.36倍，隨后逐漸降低，在恢復(fù)處理第3天時(shí)，達(dá)到第2個(gè)峰值，含量分別為處理前的3.11，1.81，2.29倍。游離脯氨酸隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增加，耐冷性強(qiáng)的品種脯氨酸含量增加程度快而且多，脯氨酸含量升高有助于提高植株的抗冷性。

3結(jié)論與討論

近年來(lái)，活性氧學(xué)說(shuō)被引入了低溫傷害的研究中,低溫環(huán)境中活性氧的毒害是植物受到低溫傷害的重要原因之一 [8]。Asada K（1989）認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的活性氧主要由SOD、抗壞血酸等清除，其中SOD的作用幾乎占 90%以上，它催化歧化為 H2O2，而多種酶（如POD和CAT）又參與了H2O2的清除, 維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境的脅迫 。低溫與弱光協(xié)同對(duì)植物帶來(lái)了嚴(yán)重的傷害，加劇了光抑制；當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者接近于致死溫度時(shí)，植物體內(nèi)抗氧化酶活性下降；低溫脅迫下，植物品種保護(hù)酶活性的強(qiáng)弱直接關(guān)系到抵御低溫弱光傷害的能力。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)低溫弱光脅迫的基本特征之一。在低溫弱光脅迫下，細(xì)胞內(nèi)積累一些物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)，維持水分平衡，物質(zhì)含量高低與快慢均可反映植物本身對(duì)逆境的適應(yīng)能力。

本試驗(yàn)中，隨著低溫弱光脅迫時(shí)間的增加，辣椒幼苗葉片的SOD活性先降低，表明辣椒幼苗對(duì)低溫弱光逆境的內(nèi)在反應(yīng)。隨后SOD、POD與APX活性升高，表明植株為避免遭受低溫弱光逆境的傷害也作出了一定的適應(yīng)性反應(yīng)，減緩氧自由基帶來(lái)的危害，部分未能清除的活性氧引起膜脂過(guò)氧化(MDA含量增加)，導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷，這與前人的研究結(jié)果是一致的。隨著脅迫時(shí)間的增加SOD、POD與APX活性逐漸降低，植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧已經(jīng)反過(guò)來(lái)影響到了抗氧化酶的活性?；钚匝跄軌蛞鹉は到y(tǒng)的脂質(zhì)過(guò)氧化而使膜受損傷，造成丙二醛積累，MDA的積累能對(duì)膜和細(xì)胞造成進(jìn)一步的傷害 [9-10]。

在恢復(fù)階段，植物并沒(méi)有隨著低溫弱光逆境的結(jié)束而結(jié)束毒害，相反卻表現(xiàn)出進(jìn)一步受傷害的狀況。恢復(fù)處理3 d，SOD、POD與APX活性表現(xiàn)出下降趨勢(shì) ，因此，低溫弱光逆境的消除并沒(méi)有使傷害得到立即減緩，而是持續(xù)了一定的時(shí)間；恢復(fù)6 d后，辣椒幼苗得到一定程度的恢復(fù)，此時(shí)植株葉片的保護(hù)酶活性得到一定恢復(fù)，傷害減輕。在培育耐低溫弱光品種過(guò)程中，我們既要考慮選育耐低溫弱光的品種，也要關(guān)注品種低溫弱光脅迫后的恢復(fù)過(guò)程。在低溫弱光脅迫過(guò)程中，脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖均有所增加，雜交種含量高于不育系與恢復(fù)系，葉片中可溶性蛋白增加尤為顯著，可能與低溫脅迫蛋白合成有關(guān)。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，雜交種F1的SOD活性、POD活性、Pr含量高于不育系A(chǔ)、恢復(fù)系R；恢復(fù)系R、雜交種F1的APX活性與可溶性糖高于不育系A(chǔ)，恢復(fù)系與雜交種的各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于不育系。我們初步可知恢復(fù)系與雜交種的耐低溫弱光性關(guān)系較大，通過(guò)選擇相應(yīng)的恢復(fù)系與不育系雜交，選育出耐低溫弱光、抗逆性強(qiáng)的雜交一代?；謴?fù)系與雜交種究竟相關(guān)性如何，有待于我們進(jìn)一步進(jìn)行多樣本試驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)僅對(duì)苗期的抗氧化酶活性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量進(jìn)行了分析，其它指標(biāo)的規(guī)律如何未知有待繼續(xù)研究。

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收稿日期：2011-10-08；修訂日期：2011-11-09

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2007D27）

作者簡(jiǎn)介：段曦（1982-），女，山東濟(jì)