熊琪 柴進(jìn) 張年 索效軍 李曉鋒 楊前平 劉洋 陳明新

摘要：利用基因組ＰＣＲ步移方法獲得豬ＳＫＩＰ轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游２ ０７５ ｂｐ啟動(dòng)子序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該序列中存在４個(gè)Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)和１個(gè)ＣｐＧ島。將啟動(dòng)子序列構(gòu)建到ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ的雙熒光素酶報(bào)告基因載體上，再利用ＲＮＡ干擾技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄因子Ｓｐ１對(duì)ＳＫＩＰ轉(zhuǎn)錄的影響。熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)Ｓｐ１的表達(dá)抑制使成肌細(xì)胞中ＳＫＩＰ啟動(dòng)子活性顯著下降，表明轉(zhuǎn)錄因子Ｓｐ１可能通過(guò)順式作用元件ＧＣ－Bｏｘ對(duì)成肌細(xì)胞分化過(guò)程中ＳＫＩＰ基因的轉(zhuǎn)錄激活起正向調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：Ｓｐ１；豬；ＳＫＩＰ；啟動(dòng)子活性；ＲＮＡ干擾

中圖分類號(hào)：Ｑ７８９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－4147-05

Role of Transcription Factors Sp1 in the Expressional Regulation of SKIP Gene in Porcine C2C12 Myoblasts

ＸＩＯＮＧ Ｑｉ１，ＣＨＡＩ Ｊｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｎｉａｎ１，ＳＵＯ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｑｉａｎ－ｐｉｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－ｘｉｎ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＳＫＩＰ． Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ２ ０７５ ｂｐ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｄ ４ Ｓｐ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｏｎｅ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ． Tｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ＳＫＩＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｐ１ ｏｎ ＳＫＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＳＫＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ through ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｐｌａｙｅｄ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ＳＫＩＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｂｙ ＧＣ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｙｏｔｕｂｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｐ１； ｐｏｒｃｉｎｅ； ＳＫＩＰ； ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ＲＮＡｉ interference

骨骼肌纖維是骨骼肌的主要組成部分，肌纖維的數(shù)量和大小直接影響家畜的胴體性狀，與遺傳因素相關(guān)。５′肌醇磷酸酶（ＳＫＩＰ）由Ｉｊｕｉｎ等［１］首先發(fā)現(xiàn)并分離，在各組織中廣泛表達(dá)，尤其在心臟、骨骼肌和腎臟中高表達(dá)，因此ＳＫＩＰ被稱為骨骼肌和腎臟富含的５′肌醇磷酸酶。通過(guò)人與豬比較圖譜，發(fā)現(xiàn)豬的ＳＫＩＰ定位在豬１２號(hào)染色體ＳＳＣ１２ｑ１．３上。其所在位置存在影響第１０肋骨背膘厚、胴體長(zhǎng)［２］、肌纖維數(shù)量［３］和大腿重［４］的ＱＴＬ區(qū)域。運(yùn)用?；驁D譜信息，發(fā)現(xiàn)牛ＳＫＩＰ定位在１９號(hào)染色體 ＢＴＡ１９ｑ１．３上，其所在位置存在影響犢牛出生重［５］的ＱＴＬ區(qū)域。ＳＫＩＰ雜合突變小鼠比目魚(yú)肌和股四頭肌的重量顯著提高［６］也印證ＳＫＩＰ具有調(diào)節(jié)骨骼肌纖維發(fā)育的功能。因此有必要進(jìn)一步研究該基因參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為弄清楚肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

限制性內(nèi)切酶、Ｔ４連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ－ＭＢＩ公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ ２０００、ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ載體等購(gòu)自全式金生物公司；染色體步移試劑盒購(gòu)自Ｃｌｏｔｅｃｈ公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．２步移引物設(shè)計(jì)和ＰＣＲ擴(kuò)增

根據(jù)豬ＳＫＩＰ第一外顯子序列， 采用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０設(shè)計(jì)步移巢式引物，如表１，引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。步移擴(kuò)增由兩輪ＰＣＲ反應(yīng)組成。第一輪ＰＣＲ反應(yīng)體積為５０ μＬ，反應(yīng)體系為 ５ μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ，１ μＬ ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），１ μＬ引物ＡＰ１和第一輪ＰＣＲ特異引物，１ μＬ文庫(kù)ＤＮＡ模版，去離子水補(bǔ)足至５０ μＬ，離心混勻。第一輪ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９４℃ ５ ｍｉｎ 后迅速加入Ｔａｑ酶１ μＬ； ９４ ℃ ２５ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ ，７個(gè)循環(huán)；然后９４ ℃ ２５ ｓ，６７ ℃ ３ ｍｉｎ ，３２ 個(gè)循環(huán)； ６７ ℃ ７ ｍｉｎ。?。?μＬ 第一輪ＰＣＲ產(chǎn)物，在１．５％的瓊脂糖中電泳檢測(cè)。確認(rèn)后繼續(xù)第二輪ＰＣＲ 反應(yīng)。除了模板、引物改變外，第二輪ＰＣＲ 反應(yīng)體系與第一輪相同。將１ μＬ第一輪ＰＣＲ產(chǎn)物（包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照）稀釋５０倍，取其中１ μＬ作為第二輪ＰＣＲ反應(yīng)的模板，引物為ＡＰ２ 和第二輪ＰＣＲ特異引物。第二輪ＰＣＲ反應(yīng)條件為： ９４ ℃預(yù)變性１０ ｍｉｎ；９４ ℃變性２５ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ ，５個(gè)循環(huán)； ９４ ℃變性２５ ｓ，６２ ℃ ３ ｍｉｎ，２０個(gè)循環(huán)； ６７ ℃延伸７ ｍｉｎ。?。?μＬ產(chǎn)物，在１．５％的瓊脂糖凝膠中電泳。

１．３生物信息學(xué)分析

在線網(wǎng)站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨ．ｈｔｍｌ分析基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ１．ｈｔｍｌ）預(yù)測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)是否有ＣｐＧ島。

１．４豬ＳＫＩＰ啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ 載體的多克隆位點(diǎn)和豬ＳＫＩＰ的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)包含ＳａｃⅠ酶切位點(diǎn)的正向引物Ｐ１Ｆ：５′-ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＴ

ＧＡ-３′和ＸｈｏⅠ酶切位點(diǎn)的反向引物ＰＲ：５′-ＣＣＣＴＣ

ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴ-３′，以豬基因組ＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。直接將符合目的片段大小的ＰＣＲ產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ＳａｃⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切，３７ ℃過(guò)夜。將ＳａｃⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切的線性化ｐＧＬ３－Bａｓｉｃ載體與目的片段按照１∶３摩爾比均勻混合，用Ｔ４連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＤＨ５α。

１．５化學(xué)合成Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ

根據(jù)在線軟件 ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／ｄｅｓｉｇｎ．ｄｏ 設(shè)計(jì)化學(xué)合成的ｓｉＲＮＡ靶序列，見(jiàn)表２。

１．５實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ

在Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ轉(zhuǎn)染Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞６ ｈ后用２％馬血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化，于分化第三天提取細(xì)胞ＲＮＡ。

ＰＣＲ反應(yīng)體系：ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ μＬ，定量引物０．５ μｍｏｌ／Ｌ， ｃＤＮＡ模板 ５００ ｎｇ，補(bǔ)去離子水至總體積為２５ μＬ。ＰＣＲ擴(kuò)增程序：９５ ℃預(yù)變性２ ｍｉｎ；９４ ℃變性２０ ｓ，５８ ℃退火２０ ｓ，７２ ℃延伸３５ ｓ，７４ ℃讀板， ４０個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣３個(gè)重復(fù)。ＰＣＲ反應(yīng)的特異性通過(guò)產(chǎn)物溶解曲線確認(rèn)。用ＢｉｏＲａｄ公司的ｉＱ５軟件分析結(jié)果。先將閾值選定在各對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線平行上升的最低點(diǎn)，得到各管的Ｃｔ值。軟件會(huì)算出每個(gè)基因Ｃｔ值的平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差和每組特異基因相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)量。應(yīng)用SPSS １３．０軟件的單因素方差方法分析不同處理組中基因的表達(dá)是否具有顯著差異，Ｐ＜０．０５為具有顯著性差異。

１．６啟動(dòng)子的熒光素酶活性分析

在重組載體和Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ共轉(zhuǎn)染Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞２４ ｈ后，小心吸棄培養(yǎng)基， ＰＢＳ洗２次。２００ μＬ／孔的Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ滴加到２４孔板的每孔細(xì)胞中，在室溫避光裂解１５ ｍｉｎ。置振蕩器振蕩３０ ｓ，將裂解完全的細(xì)胞裂解液收集到１．５ ｍＬ ＥＰ管中，－８０ ℃貯存?zhèn)溆谩z測(cè)前先在室溫中平衡細(xì)胞裂解混合液，每個(gè)樣品取１０ μＬ到黑色９６孔酶標(biāo)板中搖勻，使細(xì)胞裂解液均勻鋪滿底部。提前３０ ｍｉｎ預(yù)熱報(bào)告基因檢測(cè)儀。將樣品、工作液依次放入到檢測(cè)儀器內(nèi)，設(shè)置好程序后開(kāi)始檢測(cè)，每個(gè)樣品將會(huì)有２個(gè)熒光素酶報(bào)告值Ａ和Ｂ，Ａ值與Ｂ值的比值就是每個(gè)樣品的相對(duì)表達(dá)量。

２結(jié)果與分析

２．１豬ＳＫＩＰ啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)豬ＳＫＩＰ第一外顯子序列，設(shè)計(jì)２條特異的ＰＣＲ引物，分別為ＦＧＰＳ１和ＦＧＰＳ２。以４個(gè)不同酶切的基因組步移庫(kù)為模板，以ＦＧＰＳ１和ＡＰ１（Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ １）配對(duì)進(jìn)行第一輪ＰＣＲ反應(yīng)。將第一輪ＰＣＲ反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水稀釋50倍后作為第二輪ＰＣＲ反應(yīng)的模板，將引物ＦＧＰＳ２與ＡＰ２（Ｎｅｓｔｅｄ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ２）組合進(jìn)行第二輪ＰＣＲ擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)，第一輪ＰＣＲ反應(yīng)的產(chǎn)物均呈彌散帶（圖１－Ａ）；第二輪ＰＣＲ產(chǎn)物中，經(jīng)ＰｖｕⅡ消化后的基因組為模板擴(kuò)增出大小約３２８ ｂｐ的片段，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖１－Ｂ所示。

根據(jù)第一次ＰＣＲ步移得到ＳＫＩＰ啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)了另一對(duì)嵌套特異引物ＳＧＰＳ１和ＳＧＰＳ２對(duì)ＳＫＩＰ進(jìn)行第二次步移。同樣以４個(gè)不同酶切的基因組步移庫(kù)為模板，引物ＳＧＰＳ１與ＡＰ１組合進(jìn)行第一輪ＰＣＲ擴(kuò)增（圖２－Ａ），以ＳＧＰＳ２和ＡＰ２為巢式引物進(jìn)行第二輪ＰＣＲ擴(kuò)增（圖２－Ｂ）。在第二輪ＰＣＲ產(chǎn)物中，經(jīng)ＤｒａⅠ消化后的基因組為模板擴(kuò)增出大小約８７１ ｂｐ的片段（泳道４）。

鑒于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度偏短，再根據(jù)第二次ＰＣＲ步移得到ＳＫＩＰ啟動(dòng)子序列，又設(shè)計(jì)了一對(duì)嵌套特異引物ＴＧＰＳ１和ＴＧＰＳ２對(duì)ＳＫＩＰ進(jìn)行第三次步移。 繼續(xù)以四個(gè)不同酶切的基因組步移庫(kù)為模板，引物ＴＧＰＳ１與ＡＰ１組合進(jìn)行第一輪ＰＣＲ擴(kuò)增（圖３－Ａ），以ＴＧＰＳ２和ＡＰ２為巢式引物進(jìn)行第二輪ＰＣＲ擴(kuò)增（圖３－Ｂ）。在第二輪ＰＣＲ產(chǎn)物中，經(jīng)ＥｃｏＲ Ｖ消化后的基因組為模板擴(kuò)增出約１ １８２ｂｐ的片段（泳道４）。將３次基因組步移所得到的序列拼接起來(lái)，得到豬ＳＫＩＰ部分啟動(dòng)子序列。

２．２啟動(dòng)子序列分析

將３次基因組步移拼接得到的豬ＳＫＩＰ啟動(dòng)子區(qū)序列利用在線軟件ＴＦＳＥＡＲＣＨ預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子中的潛在順式作用元件，發(fā)現(xiàn)３個(gè)潛在的ＴＡＴＡ ｂｏｘ，２個(gè)ＭｙｏＤ結(jié)合位點(diǎn)，４個(gè)Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)和１個(gè)位于起始密碼子上游的ＣｐＧ島，如圖４所示，而４個(gè)Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)都處于ＣｐＧ島中。為了闡明ＳＫＩＰ的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，將２ ０７５ ｂｐ的啟動(dòng)子序列片段（－２ ０３８到＋３７）克隆到ｐＧＬ３載體中命名為Ｐ１，酶切鑒定如圖５。

２．３Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ的合成和干擾效果

為了深入了解Ｓｐ１對(duì)肌細(xì)胞分化過(guò)程中ＳＫＩＰ轉(zhuǎn)錄的影響，用化學(xué)合成的方法合成Ｓｐ１的干擾序列Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ，化學(xué)合成的Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ轉(zhuǎn)染分化中的肌細(xì)胞的實(shí)時(shí)定量分析如圖６所示。

實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ結(jié)果顯示，Ｓｐ１和β－ａｃｔｉｎ標(biāo)準(zhǔn)曲線制備均在線性范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線符合要求。Ｓｐ１的ｍＲＮＡ表達(dá)量在各試驗(yàn)組及對(duì)照組中整體水平差異顯著（Ｐ＜０．０５）。３個(gè)Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ在肌細(xì)胞中均抑制Ｓｐ１的表達(dá)，其中Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ２抑制率最高。

２．４Ｓｐ2-ｓｉＲＮＡ２表達(dá)抑制對(duì)肌細(xì)胞分化和ＳＫＩＰ啟動(dòng)子活性的影響

由圖7可知，Ｓｐ2－ｓｉＲＮＡ２顯著降低了ＭＨＣ和ＴｎＴ的表達(dá)，抑制了肌細(xì)胞的終末分化。利用Ｓｐ１-ｓｉＲＮＡ２與啟動(dòng)子Ｐ１共轉(zhuǎn)染肌細(xì)胞分析Ｓｐ１對(duì)肌細(xì)胞中ＳＫＩＰ表達(dá)的影響。熒光素酶活性分析表明Ｓｐ１受到干擾時(shí)，ＳＫＩＰ啟動(dòng)子的活性也顯著下降了（圖８）。表明轉(zhuǎn)錄因子Ｓｐ１可能通過(guò)順式作用元件ＧＣ－Bｏｘ對(duì)肌肉細(xì)胞分化過(guò)程中ＳＫＩＰ的轉(zhuǎn)錄激活起正向調(diào)控作用。

３討論

有研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物基因組包含未甲基化的ＣｐＧ島［７］。雖然不清楚這些區(qū)域是怎么維持非甲基化狀態(tài)的，但是在有些情況下這依賴于轉(zhuǎn)錄因子Ｓｐ１的結(jié)合［８］。Ｓｐ１是較早克隆和鑒定出的結(jié)合在ＳＶ４０啟動(dòng)子上的真核轉(zhuǎn)錄因子［９］。它包含３個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)基序，Ｃｙｓ-２-Ｈｉｓ-２，能結(jié)合在ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ序列上［１０］。Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)常在ＣｐＧ島區(qū)出現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)對(duì)維持ＡＰＲＴ基因ＣｐＧ島的非甲基化狀態(tài)十分關(guān)鍵［１１］。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的１個(gè)ＣｐＧ島區(qū)域和若干Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)Ｓｐ１轉(zhuǎn)錄因子可能是調(diào)節(jié)ＳＫＩＰ穩(wěn)定表達(dá)的潛在轉(zhuǎn)錄因子。如果沒(méi)有Ｓｐ１結(jié)合位點(diǎn)遍布ＣｐＧ島區(qū)，則ＳＫＩＰ啟動(dòng)子很容易被甲基化引起轉(zhuǎn)錄活性的抑制，但是５′肌醇磷酸酶ＳＫＩＰ是廣泛表達(dá)且在某些組織是高表達(dá)的，暗示轉(zhuǎn)錄因子Ｓｐ１可能避免基因組ＣｐＧ島被甲基化。通過(guò)Ｓｐ１ ＲＮＡ干擾分析Ｐ１啟動(dòng)子在肌細(xì)胞的活性，發(fā)現(xiàn)ＳＫＩＰ的啟動(dòng)子活性確實(shí)受細(xì)胞內(nèi)Ｓｐ１表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，Ｓｐ１轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)抑制顯著地降低了ＳＫＩＰ的活性，可見(jiàn)反式作用因子Ｓｐ１對(duì)ＳＫＩＰ的穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要。

Ｓｐ１以豐富的核蛋白形式存在于大多數(shù)細(xì)胞中，但是在不同的發(fā)育階段和不同類型的細(xì)胞中，表達(dá)水平是有差異的［１２］。Ｓｐ１對(duì)ＭｙｏＤ轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄活性和肌肉細(xì)胞的分化也有影響，有研究發(fā)現(xiàn)ｐＲｂ、ＭＤＭ２和Ｓｐ１協(xié)同調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的分化［１３，１４］。Ｓｐ１的轉(zhuǎn)錄活性受到與ＭＤＭ２蛋白互作的影響，Ｓｐ１與ＭＤＭ２的結(jié)合抑制了Ｓｐ１與肌肉特異表達(dá)基因啟動(dòng)子ＤＮＡ序列的結(jié)合，而當(dāng)Ｓｐ１與ＭＤＭ２的結(jié)合受到ｐＲｂ競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)，Ｓｐ１從Ｓｐ１－ ＭＤＭ２蛋白復(fù)合體中釋放出來(lái)，重新結(jié)合順式作用元件與ＭｙｏＤ轉(zhuǎn)錄因子家族成員共同激活肌肉特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)干擾Ｓｐ１的表達(dá)影響肌細(xì)胞的終末分化，進(jìn)一步證實(shí)Ｓｐ１對(duì)成肌分化的重要作用以及ＳＫＩＰ可能參與骨骼肌細(xì)胞分化進(jìn)程。

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［４］ ＭＩＬＡＮ Ｄ， ＢＩＤＡＮＥＬ Ｊ Ｐ， ＩＡＮＮＵＣＣＥＬＬＩ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ｃａｒｃａｓｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００２，３４（６）：７０５－７２８．

［５］ ＴＨＯＭＡＳＥＮ Ｊ Ｒ， ＧＵＬＤＢＲＡＮＤＴＳＥＮ Ｂ， ＳＯＲＥＮＳＥＮ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｃａｌｖｉｎｇ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｄａｎｉｓｈ Ｈｏｌｓｔｅｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，２００８，９１（５）：２０９８－２１０５．

［６］ ＩＪＵＩＮ Ｔ， ＹＵ Ｙ Ｅ， ＭＩＺＵＴＡＮＩ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ＳＫＩＰ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１７）：５１８４－５１９５．

［７］ ＣＲＯＳＳ Ｓ Ｈ，ＢＩＲＤ Ａ Ｐ． ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ，１９９５，５（３）：３０９－３１４．

［８］ ＭＡＣＬＥＯＤ Ｄ， ＣＨＡＲＬＴＯＮ Ｊ， ＭＵＬＬＩＮＳ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐ１ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ａｐｒｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９９４，８（１９）：２２８２－２２９２．

［９］ ＤＹＮＡＮ Ｗ Ｓ， ＴＪＩＡＮ Ｒ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，１９８３，３２（３）：６６９－６８０．

［１０］ ＬＥＴＯＶＳＫＹ Ｊ， ＤＹＮＡＮ Ｗ Ｓ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＧＣ ｂｏｘ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８９，１７（７）：２６３９－２６５３．

［１１］ ＢＲＡＮＤＥＩＳ Ｍ， ＦＲＡＮＫ Ｄ， ＫＥＳＨＥＴ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐ１ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｆｒｏｍ ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７１（６４９６）： ４３５－４３８．

［１２］ ＳＡＦＦＥＲ Ｊ Ｄ， ＪＡＣＫＳＯＮ Ｓ Ｐ， ＡＮＮＡＲＥＬＬＡ Ｍ Ｂ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｐ１ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，１１（４）：２１８９－２１９９．

［１３］ ＧＵＯ Ｃ Ｓ， ＤＥＧＮＩＮ Ｃ， ＦＩＤＤＬＥＲ Ｔ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｙｏＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＤＭ２， ｐＲｂ，ａｎｄ Ｓｐ１［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（２５）：２２６１５－２２６２２．

［１４］ ＡＲＩＺＡ Ｆ， ＨＡＲＲＩＳＯＮ Ｂ， ＤＲＩＮＫＷＡＴＥＲ Ｒ Ｄ． Ｔｈｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ ａｎｄ １７［Ｊ］． Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，３２（６）：３７１－３７４．

收稿日期：２０１２－０６－１４

基金項(xiàng)目：湖北省動(dòng)物胚胎工程及分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（２０１０ＺＤ１１１）；湖北省科技計(jì)劃自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（２０１０ＣＢＢ０１３０１）；

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金（２０１１ＮＫＹＪＪ１６）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主創(chuàng)新基金（２０１０ＢＱ００１）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師科技創(chuàng)新項(xiàng)目

（２０１１ＱＣ００１）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（２０１１－６２０－００１－００３）

作者簡(jiǎn)介：熊琪（１９８１－），女，湖北武漢人，助理研究員，博士，主要從事草食家畜的分子育種研究工作，（電話）１３０７２７１６７７２（電子信箱）

ｘｑ１２２３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；通訊作者，陳明新，研究員，（電子信箱）ｘｉｏｎｇｑｉ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。