嚴(yán)雪瑜 黃云 嚴(yán)小東 蔣欽楊 郭亞芬 蔣和生

摘要：采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析了廣西巴馬小型豬的氟烷基因類(lèi)型。結(jié)果顯示，ＰＣＲ擴(kuò)增獲得廣西巴馬小型豬氟烷基因片段長(zhǎng)４５２ ｂｐ，其堿基序列與ＧｅｎＢａｎｋ公布的普通豬同源性為９９．６％；采用ＨｈａⅠ酶切檢測(cè)廣西巴馬小型豬、巴長(zhǎng)二元雜豬和長(zhǎng)白豬氟烷基因的ＰＣＲ產(chǎn)物，均產(chǎn)生２條電泳條帶，未表現(xiàn)多態(tài)性；測(cè)序表明廣西巴馬小型豬氟烷基因第１ ８４３位堿基均為Ｃ。豬氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析技術(shù)為優(yōu)質(zhì)豬的培育提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：廣西巴馬小型豬；氟烷基因；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ８２８．８＋９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－4144-03

Analysis on Halothane Gene in Guangxi Bama Mini-pig with PCR-RFLP

ＹＡＮ Ｘｕｅ－ｙｕ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕn１，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｄｏｎｇ２，ＪＩＡＮＧ Ｑｉｎｇ－ｙａｎｇ１，ＧＵＯ Ｙａ－ｆｅｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｈｅ－ｓｈｅｎｇ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４，Ｃｈｉｎａ；

２．Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ， Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ ５３８０２１，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ hａｌｏｔｈａｎｅ（Ｈａｌ） ｇｅｎｅ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ was ａｎａｌｙｓｉｚｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗａｓ ４５２ ｂｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ９９．６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ． Ｔｗｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇｓ， Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ×Ｌａｎｄｒａｃｅ ｃｒｏｓｓｂｒｅｄｓ ａｎｄ Ｌａｎｄｒａｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＨｈａⅠ without ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ １８４３ｒｄ ｂａｓｅ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ Ｃ． ＰＣＲ－ＲＦＬＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｉｇ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ； hａｌｏｔｈａｎｅ ｇｅｎｅ； ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

豬應(yīng)激綜合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＳＳ）易導(dǎo)致豬應(yīng)激而突然死亡或產(chǎn)生白肌肉，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ＰＳＳ是由于氟烷基因（Ｈａｌｏｔｈａｎｅ，Ｈａｌ）或稱(chēng)骨骼肌蘭尼定受體基因（Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ，ＲＹＲ１）突變所致，蘭尼定受體基因ＣＤＳ序列的Ｃ１８４３→Ｔ１８４３突變致使受體蛋白的第６１５位的氨基酸發(fā)生變異（Ａｒｇ→Ｃｙｓ），引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變；這種改變使豬在應(yīng)激狀態(tài)下肌肉組織中大量的Ｃａ２＋異常釋放，引起血漿β－內(nèi)啡呔過(guò)量分泌，電解質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，發(fā)生肌肉持續(xù)收縮，進(jìn)而使豬產(chǎn)生惡性高熱；肌肉組織收縮需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解來(lái)獲得能量，致使乳酸產(chǎn)生過(guò)多，肌肉ｐＨ異常降低，出現(xiàn)ＰＳＥ肉［１］。內(nèi)切酶ＨｈａⅠ能識(shí)別野生型ＨａｌＮ基因的５－ＧＣＧ↓Ｃ－３，即Ｃ１８４３位點(diǎn)，因此，可利用內(nèi)切酶ＨｈａⅠ檢測(cè)Ｃ１８４３→Ｔ１８４３突變位點(diǎn)來(lái)判斷豬的應(yīng)激敏感性。

不同豬種攜帶Ｈａｌｎ基因的頻率不一樣。文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)地方豬種Ｈａｌｎ基因的頻率為：二花臉豬０．５７％［２］、民豬１０％～１６．６７％［２-４］，而內(nèi)江豬、版納豬、五指山小耳豬、藏豬均為０［５］。廣西巴馬小型豬或稱(chēng)巴馬香豬尚未見(jiàn)此類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道。巴馬香豬主產(chǎn)于廣西區(qū)巴馬瑤族自治縣，其以體型矮小，皮薄肉細(xì)，肉質(zhì)鮮美而聞名于世。本試驗(yàn)研究建立氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ突變檢測(cè)技術(shù)，為廣西巴馬小型豬的選育和資源合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)動(dòng)物

廣西巴馬小型豬來(lái)源于廣西大學(xué)巴馬小型豬原種場(chǎng)。長(zhǎng)白豬和巴長(zhǎng)二元雜豬來(lái)源于廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)習(xí)基地豬場(chǎng)。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１引物的設(shè)計(jì)與合成針對(duì)Ｈａｌ （ＲＹＲ１）基因內(nèi)含子１６后端序列、外顯子１７全部序列、內(nèi)含子１７前端序列設(shè)計(jì)引物，其中Ｈａｌ基因 ＣＤＳ序列第１ ８４３位突變檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)外顯子１７的第１８ ６１８位點(diǎn)。引物序列為Ｐｒｉｍｅｒ（ｕｐ）：５′－ＧＡＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣ

ＴＧＡＧＴＣＧＧ－３′；Ｐｒｉｍｅｒ（ｄｏｗｎ）：５′－ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ

ＧＣＴＧＡＴＧ－３′。

１．２．２基因組ＤＮＡ的提取豬血液總ＤＮＡ提取按照基因組ＤＮＡ提取試劑盒操作。

１．２．３ＰＣＲ反應(yīng)ＰＣＲ反應(yīng)體系：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ＭｇＣｌ２ １．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，Ｐｒｉｍｅｒｓ（ｕｐ，ｄｏｗｎ） ０．７ μＬ，Ｔａｑ酶 ０．３ μＬ，總ＤＮＡ模板５ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５ μＬ。

ＰＣＲ 反應(yīng)程序：預(yù)變性９４ ℃，５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，６１ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３４個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，于４ ℃保存。

１．２．４克隆與測(cè)序?qū)⒛z回收純化克隆連接到ｐＭＤ－１８Ｔ 載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ＤＨ５α大腸桿菌。經(jīng)菌液ＰＣＲ鑒定、質(zhì)粒酶切鑒定，重組陽(yáng)性菌液送至英駿（上海）生物技術(shù)有限公司和深圳華大基因生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

１．２．５ＰＣＲ－ＲＦＬＰ酶切鑒定采集廣西巴馬小型豬、巴長(zhǎng)二元雜豬和長(zhǎng)白豬血樣并提取基因組ＤＮＡ，ＰＣＲ擴(kuò)增目的片段，用ＨｈａⅠ將ＰＣＲ產(chǎn)物在３７ ℃酶切４ ｈ，酶切產(chǎn)物用１％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

２結(jié)果與分析

２．１測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，成功克隆了廣西巴馬小型豬氟烷基因的部分序列，長(zhǎng)度為４５２ ｂｐ，包含內(nèi)含子１６后端的２４５ ｂｐ，外顯子１７的１３４ ｂｐ，內(nèi)含子１７前端的７３ ｂｐ。在線Ｂｌａｓｔ同源比對(duì)表明，廣西巴馬小型豬氟烷基因序列與ＧｅｎＢａｎｋ公布的Ｚ４９７７８．１普通豬同源性為９９％，有２處堿基差異，均出現(xiàn)在內(nèi)含子１６上。廣西巴馬小型豬Ｈａｌ基因部分序列比對(duì)結(jié)果如圖１所示。

２．２ＰＣＲ－ＲＦＬＰ結(jié)果

由圖２、圖３、圖４可知，廣西巴馬小型豬、巴長(zhǎng)二元雜豬和長(zhǎng)白豬３種豬的ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)ＨｈａⅠ酶切，電泳均產(chǎn)生２條帶，估計(jì)大小分別為１５７ ｂｐ和２９５ ｂｐ，未表現(xiàn)出多態(tài)性，沒(méi)有檢測(cè)到氟烷基因第１ ８４３位點(diǎn)突變，即試驗(yàn)豬群不攜帶Ｔ１８４３。

３討論

３．１氟烷基因點(diǎn)突變的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析

氟烷基因編碼序列第１ ８４３位堿基突變是引起豬應(yīng)激綜合征的主要誘因，對(duì)該位點(diǎn)的檢測(cè)是判斷豬是否易感ＰＳＳ的可靠途徑。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技術(shù)是利用限制性?xún)?nèi)切酶特異性剪切作用來(lái)鑒定目標(biāo)堿基的突變類(lèi)型，方法可靠、簡(jiǎn)單、快速。本研究對(duì)廣西巴馬小型豬、長(zhǎng)白豬、巴長(zhǎng)二元雜豬的Ｈａｌ基因進(jìn)行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，結(jié)果表明廣西巴馬小型豬沒(méi)有檢測(cè)到Ｈａｌｎ基因，不會(huì)發(fā)生ＰＳＳ，與帥素容等［５］報(bào)道的結(jié)果相似。

３．２氟烷基因?qū)ωi肉品質(zhì)的影響

氟烷基因是影響肉質(zhì)的一個(gè)主效基因，是產(chǎn)生ＰＳＥ肉和ＤＦＤ肉的遺傳基礎(chǔ)［７］，因此，對(duì)Ｈａｌ基因型分析是雜交培育優(yōu)良肉質(zhì)豬的可靠依據(jù)之一。劉顯軍等［８］研究表明，ＨａｌＮＮ型豬肌肉Ｈａｒｔ透過(guò)率比ＨａｌＮｎ豬的高，而揮發(fā)性鹽基氮含量要低些，這說(shuō)明在屠宰后的鮮肉中，肌肉蛋白變性的速度前者比后者緩慢，形成劣質(zhì)肉的可能性要小。肌肉Ｈａｒｔ透過(guò)率是評(píng)定肌肉蛋白變性程度的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為，Ｈａｒｔ透過(guò)率越小，肌肉蛋白變性程度越大，肌肉保持水分的能力越小，劣質(zhì)肉的發(fā)生概率增大。

３．３氟烷基因?qū)ωi繁殖性能的影響。

豬氟烷基因隱性突變對(duì)繁殖性能產(chǎn)生不良影響。蔣思文等［9］報(bào)道豬氟烷基因陰性（Ｈａｌｎｎ）比陽(yáng)性（ＨａｌＮＮ）、雜合子（ＨａｌＮｎ）每窩產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)少２．０～２．７頭，繁殖性能ＮＮ﹥Ｎｎ﹥ｎｎ。姜?jiǎng)灼降龋郏?］研究表明，攜帶ｎ等位基因可降低母豬的產(chǎn)仔數(shù)和仔豬成活率，對(duì)繁殖性能有不良的遺傳效應(yīng)。劉海峰等［１1］報(bào)道豬氟烷基因ＮＮ型個(gè)體３５日齡斷奶成活率顯著高于Ｎｎ型個(gè)體。鞠慧萍等［１2］報(bào)道，經(jīng)產(chǎn)母豬ＮＮ型的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶仔豬數(shù)和初生窩重顯著高于Ｎｎ型、ｎｎ型；張新銀等［１3］研究表明，經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)在不同基因型間表現(xiàn)出ＮＮ＞Ｎｎ＞ｎｎ的趨勢(shì)；攜帶有Ｈａｌｎｎ基因的母豬對(duì)應(yīng)激高度敏感，受到應(yīng)激后難以配種，懷孕后極易流產(chǎn)。

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收稿日期：２０１２－０２－０６

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻１０１００００５－１１）

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)雪瑜（１９８８－），女，廣西防城港人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，（電話）１５８０７７１１６４６（電子信箱）ｊｉａｎｇｑｉｎｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；

通訊作者，蔣欽楊，副教授。