李蕊聯(lián)等

[摘要]目的：比較點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）對老化昆明小鼠真皮重塑的作用，并探討二者嫩膚作用機(jī)制，為臨床選擇治療方法提供理論依據(jù)。方法：應(yīng)用兩種波長激光照射自然老化昆明小鼠背部脫毛皮膚，通過HE染色進(jìn)行成纖維細(xì)胞計數(shù)及真皮厚度測量，飽和苦味酸-天狼猩紅染色觀察皮膚Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)及Gomori醛品紅染色觀察彈力纖維的變化。結(jié)果：兩組照射組中真皮厚度、成纖維細(xì)胞計數(shù)和彈力纖維容積分?jǐn)?shù)的值均高于正常對照組（P均<0.05）；點(diǎn)陣CO2激光組均高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）組（P均<0.05）；兩組照射組中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)均高于正常對照組（P均<0.05），但照射兩組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）均可引發(fā)小鼠真皮重塑，前者效果優(yōu)于后者。

[關(guān)鍵詞]點(diǎn)陣CO2激光；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）；自然老化小鼠；真皮重塑

[中圖分類號]R616.4R332[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

激光醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于皮膚科的臨床實(shí)踐中。近幾年，非剝脫性激光以及點(diǎn)陣激光的發(fā)展更為迅速，已經(jīng)占有了一席之地[1-2]。雖然有關(guān)兩者作用機(jī)制的研究也有報道[3-4]，但是二者針對皮膚組織結(jié)構(gòu)作用機(jī)制的比較研究卻鮮見報道。通過對二者作用的靶組織或細(xì)胞變化的深入比較研究，可以進(jìn)一步揭開二者作用差異的面紗，為臨床制定具體治療方法提供理論依據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在分析點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）對昆明小鼠真皮的影響并進(jìn)行對比研究，以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制的差異。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級雌性自然老化昆明小白鼠24只，體重（45±7）g，鼠齡11～12個月，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2儀器設(shè)備：點(diǎn)陣CO2激光治療儀（上海康奧），Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）（韓國Lutronic S6）；石蠟切片機(jī)（德國Leica）；偏振光顯微鏡（奧林巴斯）；光學(xué)顯微鏡及醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔麻醉。小鼠背部皮膚脫毛后，以脊柱為縱線和垂直于脊柱縱線的二分之一處為橫線將背部皮膚分為四個區(qū)。左側(cè)為對照區(qū)，不做任何處理；右側(cè)頭部區(qū)為點(diǎn)陣CO2激光照射區(qū)（簡稱點(diǎn)陣區(qū)），尾部區(qū)為Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射區(qū)（簡稱長脈寬區(qū)）。照射區(qū)皮膚用1‰新潔爾滅常規(guī)消毒后自然干燥。點(diǎn)陣CO2激光照射的能量為50mJ/cm2，正方形光斑（4mm×4mm），脈寬2ms，密度100/cm2，光斑之間不重疊照射一遍；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射的能量為14.1mJ/cm2，圓形光斑（3.0mm），脈寬0.3ms，光斑重疊1/3，照射兩遍；兩組照射面積均約2cm×2cm。24只小鼠激光照射4次，每次間隔10天，全部照射結(jié)束后，分別在第2周、1個月、3個月各處死8只小鼠，分別取每只小鼠四個部位的皮膚用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 組織學(xué)觀察：每只小鼠的四塊樣本，以10%甲醛溶液固定，乙醇梯次濃度逐級脫水，石蠟包埋，切片。常規(guī)HE切片用于計算成纖維細(xì)胞計數(shù)及測量真皮厚度；飽和苦味酸-天狼猩紅染色切片用偏振光顯微鏡照相以分析Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維含量；Gomori醛品紅染色切片用于分析彈力纖維含量。以上所有切片標(biāo)本均以每張切片隨機(jī)選取三個視野，用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析，最后取均值作為該切片的分值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。相關(guān)表格均由Microsoft Excel 2007繪制。計量資料采用x±s進(jìn)行描述，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后， Wilcoxon秩檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)用于兩組間的比較，方差分析比較各時間段之間的差別，兩兩比較采用LSD法，規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

肉眼觀察可見點(diǎn)陣CO2激光照射自然老化昆明小白鼠后，照射區(qū)域皮膚表面即刻呈現(xiàn)均勻的黃褐色點(diǎn)狀結(jié)痂，輕度水腫，次日水腫消失，點(diǎn)狀結(jié)痂3～7日脫落。脫痂后皮膚表面光滑，無瘢痕及色素異常；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射區(qū)域皮膚表面微紅，無結(jié)痂，次日皮膚基本恢復(fù)正常。

2.1 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射對成纖維細(xì)胞數(shù)量及真皮厚度的影響：點(diǎn)陣CO2激光和Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個月及3個月，HE染色標(biāo)本顯示兩種激光照射區(qū)相對于對照區(qū)成纖維細(xì)胞計數(shù)及真皮厚度均顯著增加，點(diǎn)陣CO2激光照射較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射效果明顯（見表1、表2、圖2）。在照射后一個月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）成纖維細(xì)胞計數(shù)及真皮厚度差別顯著（見圖1）。

2.2 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射對膠原增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射自然老化昆明小白鼠后，經(jīng)偏振光鏡檢飽和苦味酸-天狼猩紅切片可見Ⅰ型膠原纖維呈紅黃色，較粗大，而Ⅲ型膠原纖維呈綠色細(xì)絲狀，交織于Ⅰ型膠原纖維間。在兩波長激光分別照射后2周、1個月及3個月，照射區(qū)與對照區(qū)相比，Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見表3、表4、圖4）。點(diǎn)陣CO2激光與Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射后一個月的Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差別不明顯（見圖3）。

2.3點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射對彈力纖維增生的影響：點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1個月及3個月，Gomori醛品紅染色標(biāo)本顯示照射區(qū)彈力纖維染色深，呈較長細(xì)絲狀，波浪狀交織于增生膠原纖維間（見圖5箭頭所示），而對照區(qū)真皮彈力纖維短、染色淺；在激光照射后一個月，點(diǎn)陣CO2激光較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射區(qū)的彈力纖維容積分?jǐn)?shù)增加明顯（見表5、圖6）。

2.4 點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射區(qū)在不同時間段的方差：分析比較：（見表6）。

3討論

2004年Manstein等[2]發(fā)表點(diǎn)陣式光熱作用（fractional photothermolysis， FP）理論，并迅速應(yīng)用于臨床，減少了治療風(fēng)險，并顯現(xiàn)出良好的療效。點(diǎn)陣CO2激光照射的是小部分皮膚，為三維的熱治療區(qū)域（Microscopic treatment zones，MTZs），每個MTZ形成熱損傷區(qū)域（10～100μm），其外周為未損傷的正常組織。點(diǎn)狀的損傷可以通過周圍存在的未受損細(xì)胞遷移使表皮細(xì)胞迅速修復(fù)，從而使治療后皮膚能快速恢復(fù)，無需休假，避免了傳統(tǒng)剝脫性治療的風(fēng)險[5]。Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）幾乎不損傷表皮細(xì)胞即可達(dá)到嫩膚的作用[6]。

皮膚老化常表現(xiàn)為皺紋、皮膚彈性下降、色素?fù)p害、毛細(xì)血管擴(kuò)張等。顯微鏡下組織學(xué)改變表現(xiàn)為膠原纖維、彈力纖維減少，真皮層變薄。真皮層的主要結(jié)構(gòu)為大量的成束的縱橫交錯的膠原纖維和少量的彈性纖維組織。因此，所謂的真皮重塑主要表現(xiàn)或者指標(biāo)也就是Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成的重新啟動。諸多的研究已證實(shí)激光照射后Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維合成大于降解[7，8]。點(diǎn)陣激光照射后Ⅲ型膠原纖維3天開始合成[9]，7天可見Ⅲ型膠原纖維沉積[10]。點(diǎn)陣CO2激光治療面部萎縮性痤瘡瘢痕[11]及手背部皮膚[12]，發(fā)現(xiàn)1個月時痤瘡疤痕及皮膚光老化改善明顯，有新的膠原沉積。國內(nèi)羅瑤佳等[13]用超脈沖二氧化碳點(diǎn)陣激光治療皮膚痤瘡瘢痕，于1個月及3個月時觀察療效滿意。Chiba等[4]在用Nd：YAG激光進(jìn)行面部嫩膚治療后發(fā)現(xiàn)改善皺紋，皮膚質(zhì)地及松弛效果明顯，真皮乳頭層膠原纖維沉積明顯。以上報道基本與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[14]。本實(shí)驗(yàn)研究對象為自然老化小鼠，與人類的自然老化有相同之處，通過對其研究可以為人類臨床美膚提供科學(xué)理論依據(jù)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)2周時在照射區(qū)域出現(xiàn)Ⅰ型膠原纖維沉積，1月時達(dá)到最高值，3月時沉積較前減少，但仍高于對照區(qū)，這些結(jié)果有助于我們了解激光照射后刺激膠原纖維合成的時間；而Ⅲ型膠原纖維至3月時仍呈現(xiàn)明顯沉積趨勢，其合成大于降解[9]，可能與Ⅲ型膠原纖維在老化皮膚沉積較多有關(guān)[16]；同時，彈力纖維亦呈現(xiàn)出時間依賴性沉積關(guān)系[17]；均表明其臨床治療間隔可以在三個月以后進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，點(diǎn)陣CO2激光及Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）照射均可明顯引發(fā)真皮重塑，前者較后者具有更好的照射效果，造成這種差異的可能原因在于點(diǎn)陣CO2激光的波長（10600nm）高于Nd：YAG激光波長（1 064nm）。相比而言，較長的點(diǎn)陣CO2激光波長穿透能力強(qiáng)，可達(dá)真皮的中層，能夠更好的將機(jī)械效應(yīng)及光熱效應(yīng)作用于真皮中上層的成纖維細(xì)胞及真皮血管，激活組織自我修復(fù)，其中成纖維細(xì)胞和真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子可能參與組織修復(fù)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，使膠原蛋白發(fā)生重組和增生；Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）其作用機(jī)理可能是真皮及其血管受激光光熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)損傷，膠原蛋白熱變性，繼而激活組織修復(fù)過程，引發(fā)成纖維細(xì)胞增殖，引起膠原蛋白重組增生以達(dá)到真皮重塑的目的[6]。點(diǎn)陣CO2激光照射后的成纖維細(xì)胞數(shù)目及真皮厚度在1個月時較Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長）照射效果明顯，但其長期效果并不具有明顯優(yōu)勢，說明二者均能有效改善皮膚質(zhì)地、增加皮膚彈性，是進(jìn)行真皮重塑的很好的選擇。比較多位學(xué)者的治療結(jié)果，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)陣CO2激光效果雖好，但點(diǎn)陣CO2激光治療時患者的疼痛感高于Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1064nm波長），且恢復(fù)期也較長[4，11]。相對臨床而言，二者皆可作為治療皮膚光老化進(jìn)行真皮重塑的良好選擇[3，18]，Nd：YAG激光（準(zhǔn)長脈寬1 064nm波長）損傷小，停工期短，更適合現(xiàn)在的快節(jié)奏生活，但對于較重的老化皮膚或?qū)Ο熜в袕?qiáng)烈愿望，建議用點(diǎn)陣CO2激光。本實(shí)驗(yàn)未明確真皮發(fā)生變化的分子機(jī)理，有待于在今后的學(xué)習(xí)中進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Laubach H， Chan H H， Rius F， et al. Effects of skin temperature on lesion size in fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med， 2007，39（1）：14-18.

[2]Manstein D， Herron G S， Sink R K， et al. Fractional photothermolysis： a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury[J]. Lasers Surg Med， 2004，34（5）：426-438.

[3]Helbig D， Paasch U. Molecular changes during skin aging and wound healing after fractional ablative photothermolysis[J]. Skin Res Technol， 2011，17（1）：119-128.

[4]Chiba C， Usui A， Hara H， et al. Clinical experience in skin rejuvenation treatment in Asians using a long-pulse Nd：YAG laser[J]. J Cosmet Laser Ther， 2009，11（3）：134-138.

[5]Geronemus R G. Fractional photothermolysis： current and future applications[J]. Lasers Surg Med， 2006，38（3）：169-176.

[6]Orringer J S， Voorhees J J， Hamilton T， et al. Dermal matrix remodeling after nonablative laser therapy[J]. J Am Acad Dermatol， 2005，53（5）：775-782.

[7]Orringer J S， Rittie L， Baker D， et al. Molecular mechanisms of nonablative fractionated laser resurfacing[J]. Br J Dermatol， 2010，163（4）：757-768.

[8]Dang Y，Ye X，Weng Y，et al.Effects of the 532-nm and 1，064-nm Q-switched Nd：YAG lasers on collagen turnover of cultured human skin fibroblasts： a comparative study[J]. Lasers Med Sci， 2010，25（5）：719-726.

[9]Helbig D，Bodendorf MO， Grunewald S，et al.Immunohistochemical investigation of wound healing in response to fractional photothermolysis[J]. J Biomed Opt， 2009，14（6）：64044.

[10]Laubach HJ，Tannous Z，Anderson RR，et al.Skin responses to fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med，2006，38（2）：142-149.

[11]Manuskiatti W，Triwongwaranat D，Varothai S，et al. Efficacy and safety of a carbon-dioxide ablative fractional resurfacing device for treatment of atrophic acne scars in Asians[J]. J Am Acad Dermatol，2010，63（2）：274-283.

[12]Sadick N S， Smoller B. A study examining the safety and efficacy of a fractional laser in the treatment of photodamage on the hands[J]. J Cosmet Laser Ther， 2009，11（1）：29-33.

[13]羅瑤佳，吳嚴(yán)，高興華，等. 超脈沖二氧化碳點(diǎn)陣激光治療痤瘡瘢痕的臨床觀察[J].中國美容醫(yī)學(xué)， 2011（1）：93-95.

[14]Rerknimitr P，Pongprutthipan M，Sindhuphak W.Fractional photothermolysis for the treatment of facial wrinkle in Asians[J]. J Med Assoc Thai， 2010，93 Suppl 7：S35-S40.

[15]叢敬，吳景東.老化皮膚成纖維細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 中國美容醫(yī)學(xué)， 2009（5）：736-738.

[16]Lovell C R， Smolenski K A， Duance V C， et al. Type I and III collagen content and fibre distribution in normal human skin during ageing[J]. Br J Dermatol， 1987，117（4）：419-428.

[17]Lee J Y， Kim Y K， Seo J Y， et al. Loss of elastic fibers causes skin wrinkles in sun-damaged human skin[J]. J Dermatol Sci， 2008，50（2）：99-107.

[18]Wattanakrai P，Rojhirunsakool S，Pootongkam S.Split-face comparison of long-pulse-duration neodymium-doped yttrium aluminum garnet （Nd：YAG） 1，064-nm laser alone and combination long-pulse and Q-switched Nd：YAG 1，064-nm laser with carbon photoenhancer lotion for the treatment of enlarged pores in Asian women[J].Dermatol Surg， 2010，36（11）：1672-1680.

[收稿日期]2012-06-15[修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟