賈倩　李東方等

摘要：利用Ｍｌｏ蛋白質(zhì)保守域設計兼并引物，以２４個抗性不同的小麥品種為試驗材料，采用抗病基因類似物（ＲＧＡ）法探索小麥白粉病抗病基因快速有效篩選及利用的新方法。結(jié)果表明，所用的小麥抗病材料基因組ＤＮＡ與兼并引物同源區(qū)的序列變化較感病材料大，導致擴增效率較低；兼并引物在抗病及感病材料中擴增結(jié)果類似，僅從這一結(jié)果無法判斷擴增出的ＲＧＡ與小麥白粉病基因間的關系，需要通過下游轉(zhuǎn)化、克隆、測序來進一步篩選抗病相關ＲＧＡ。

關鍵詞：白粉??；Ｍｌｏ蛋白質(zhì)；保守域；抗病基因類似物（ＲＧＡ）

中圖分類號：Ｑ９４３．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5798-03

小麥白粉病是小麥生產(chǎn)上的重要病害。利用抗病品種是防治小麥白粉病最經(jīng)濟有效的措施。培育、推廣不同來源的抗性基因聚合體品種或?qū)⒖剐曰虿煌钠贩N進行合理布局，避免抗源單一化，可以有效地減緩小麥白粉病菌優(yōu)勢菌株的繁殖速度和延緩品種抗性喪失的速度［１］。因此，如何獲取新抗源是小麥白粉病抗病育種的關鍵。大麥中隱性突變基因Ｍｌｏ介導了一類單基因控制的、非小種?；?、持久的白粉病抗性［２］，是獲取新抗源的又一重要途徑。

試驗通過對Ｍｌｏ蛋白質(zhì)保守域ＭＪ４－ＭｒｃＤ２區(qū)的擴增來獲得小麥抗白粉病基因，為尋找快速有效的抗白粉病基因新篩選方法及其在作物育種上的有效利用提供技術(shù)支持。

１ 材料與方法

１．１ 材料

試驗選用的小麥材料見表１。

１．２ 方法

１．２．１ 兼并引物的設計 根據(jù)來自普通小麥、大麥、玉米、粳稻、秈稻等物種的８個Ｍｌｏ基因所編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)保守域設計兼并引物（所依據(jù)的保守域見表２，序列比對所用基因編碼的蛋白質(zhì)見表３），采用的數(shù)據(jù)庫及序列分析比對軟件有ＣＤＤ、CｌｕｓｔａｌＸ１．８、Pｒｉｍｅｒ５．０等。

１．２．２ 小麥基因組ＤＮＡ的提取 采用ＣＴＡＢ法。

１．２．３ ＰＣＲ擴增及電泳 ＰＣＲ體系采用２０μＬ：ＤＮＡ模板１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，ｄＮＴＰｓ２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１２．６μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４μＬ，上下游引物各１μＬ。ＰＣＲ循環(huán)參數(shù)：９４℃預變性４ｍｉｎ；９４℃變性１ｍｉｎ，５０℃退火１．５ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，４０個循環(huán)；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃，保存。采用１．２％瓊脂糖凝膠進行電泳，緩沖液為１×ＴＡＥ；電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，保存。

２ 結(jié)果與分析

由圖１和圖２可知，抗病材料中除１、２、３、５、６沒有擴增出結(jié)果外，７、８、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２３、２４都擴增出了目標條帶，抗病材料中能擴增出目標條帶的頻率是６６．７％（１０／１５）；感病材料４沒有擴增出結(jié)果，９、１０、１１、１６、１７、１９、２１、２２中都擴增出了目標條帶，感病材料中能擴增出目標條帶的頻率是８８．９％（８／９）。所有目標擴增帶大小都在５００ｂｐ左右，基本符合兼并引物設計時的預期結(jié)果。研究中兼并引物在抗病材料中擴增效率較低而在感病材料中擴增效率較高的事實，暗示試驗所用小麥感病材料的基因組ＤＮＡ與兼并引物序列的同源區(qū)序列相似性要高于抗病材料，或者說抗病材料基因組ＤＮＡ與兼并引物同源區(qū)序列變化較大導致擴增效率較低。

通過植物抗病（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｒ）基因的保守域擴增ＲＧＡ的主要目的是分離植物的抗病基因或作為分子標記跟蹤抗病基因。ＲＧＡ與Ｒ基因的關系可分為３種：ＲＧＡ是Ｒ基因或其假基因的一部分；ＲＧＡ與Ｒ基因緊密連鎖；ＲＧＡ與已知的Ｒ基因無關［３］。兼并引物在抗病及感病材料中擴增結(jié)果類似，僅從這一結(jié)果無法判斷擴增出的ＲＧＡ與小麥白粉病基因間的關系。由于兼并引物序列的兼并性，其在不同小麥材料中即使擴增產(chǎn)物大小一致但序列應該是不一樣的?？梢詫υ囼炛械玫降臄U增片段進行回收，然后進行測序及序列比對分析驗證。從每個回收的擴增帶轉(zhuǎn)化的單克隆中挑選多個（１０～２５個）進行測序應該能找到抗病品種中所特異出現(xiàn)的序列，該序列很有可能是抗病基因的一部分或與抗病基因緊密連鎖。這為進一步克隆抗病基因或進行抗病基因分子標記篩選打下了堅實基礎。

３ 討論

在不同抗源材料中全面發(fā)掘新抗源，培育積累不同類型的植物抗?。ǎ襡sistance，R）基因盡可能多的小麥新品種；或者在農(nóng)作物生產(chǎn)上保證多樣性抗源使具有不同Ｒ基因的品種合理布局，以Ｒ基因的遺傳多樣性來抑制新毒性小種的產(chǎn)生和蔓延，這些措施對于加快小麥新抗病品種培育及提高抗病品種的抗性持久性有重要意義［４－６］。研究表明，Ｒ基因具有特殊的保守域，通過保守域擴增抗病基因類似序列（ＲＧＡ）是分離植物抗病基因的重要途徑，也是篩選抗病基因分子標記的重要手段［７］。保守域擴增中簡并引物的設計是關鍵，簡并度越低，產(chǎn)物特異性越強，但擴增效率會隨之降低；反之，簡并度越高，擴增效率越高，但產(chǎn)物的特異性會降低，簡并度的大小需要根據(jù)不同抗病基因及其具體的保守域位點來確定。

大麥Ｍｌｏ基因與以往克隆的任何Ｒ基因的結(jié)構(gòu)都沒有同源關系，是一類植物所特有的新型的抗病基因［２］。Ｋｉｍ等［8］克隆了水稻Ｍｌｏ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＭｌｏ，ＯｓＭｌｏ）基因，并闡明ＯｓＭｌｏ編碼一個６２ｋｕ的蛋白質(zhì)，其功能也是負向調(diào)節(jié)廣譜抗病性與葉細胞死亡。研究采用類似ＲＧＡ法，以Ｍｌｏ蛋白質(zhì)保守域ＭＪ４－ＭｒｃＤ２區(qū)為目標，通過ＰＣＲ擴增來獲得小麥新的抗白粉病基因，獲得了初步結(jié)果，可以為尋找快速有效的抗白粉病基因新篩選方法及其在作物育種上有效利用提供一定的參考。

參考文獻：

［１］韓德俊，曹 莉，陳耀鋒，等．植物抗病基因與病原菌無毒基因互作的分子基礎［Ｊ］．遺傳學報，２００５，３２（１２）：１３１９－１３２６．

［２］韓德俊，李振岐，曹 莉，等．大麥抗白粉病基因Ｍｌｏ的研究進展［Ｊ］．西北植物學報，２００３，２３（３）：４９６－５０２．

［３］秦跟基，李萬隆，陳佩度．植物抗病基因結(jié)構(gòu)特征及其類似序列的研究進展［Ｊ］．南京農(nóng)業(yè)大學學報，１９９９，２２（３）：１０２－１０７．

［４］陳曉梅，郭順星．ＲＧＡ植物抗病性物質(zhì)的研究進展［Ｊ］．植物學通報，１９９９，１６（６）：６５８－６６４．

［５］徐冰強，杜中軍，黃俊生．ＲＧＡ法克隆候選抗病基因的研究進展［Ｊ］．分子植物育種，２００４，２（３）：４２１－４２８．

［６］李春來，張懷渝．植物抗病基因同源序列（ＲＧＡ）研究進展［Ｊ］．分子植物育種，２００４，２（６）：８５３－８６０．

［７］ＫＯＮＧＷ，ＦＡＮＧＸＪ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆＮＢＳ－ＬＲＲｔｙｐｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅａｎａｌｏｇｓｉｎｃｏｔｔｏｎ（ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅＬ１）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００３，１（３）：４２７－４２９．

［８］KIMMC，LEESH，KIMJK，etal．Mlo，amodulatorofplantdefenseandcelldeath，isanovelcalmodulin-bindingprotein.［Ｊ］．TheJournalofBiologicalChemistry，２００2，22７（２2）：19304－19314．