張志剛　楊自文　王開梅　張遵霞　張亞妮

摘要：小麥白粉病是由子囊菌亞門真菌小麥白粉病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ）引起的一種世界性小麥病害。小麥白粉病菌無(wú)法在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，基于植株的篩選方式難以適用于室內(nèi)高通量篩選。試驗(yàn)通過分析小麥白粉病在室內(nèi)植株上的發(fā)病特點(diǎn)，進(jìn)行了離體葉片人工接種方法的探索，對(duì)影響小麥白粉病侵染的主要因素進(jìn)行了研究，建立了基于離體葉片法和低壓微量噴霧法的高通量篩選方法。利用該方法對(duì)２種抗真菌劑進(jìn)行了室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)４８０份放線菌液體搖瓶發(fā)酵提取物進(jìn)行了殺菌活性篩選。結(jié)果表明，該方法能穩(wěn)定、高效地進(jìn)行先導(dǎo)化合物篩選。

關(guān)鍵詞：小麥白粉??；人工接種；殺菌活性；葉片法篩選

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．９５；Ｓ４３５．１２１．４＋６ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5643-03

因?yàn)樾←湴追鄄【ǎ拢欤酰恚澹颍椋幔纾颍幔恚椋睿椋?，原名Ｅｒｙｓｉｐｈｅｇｒａｍｉｎｉｓ）不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和繁殖，針對(duì)小麥白粉病的先導(dǎo)化合物篩選只能在植物葉片上進(jìn)行。離體葉片篩選法具有省時(shí)、低消耗、用藥量極少以及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被作為室內(nèi)高通量篩選的首選方法。通過實(shí)際篩選的檢驗(yàn)和調(diào)整，該篩選模式從靶標(biāo)培養(yǎng)到數(shù)據(jù)處理的整個(gè)流程已經(jīng)趨于成熟。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)材料

１．１．１ 水培法室內(nèi)培養(yǎng)的小麥葉片 小麥種子浸種１ｄ后播種在裝有營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆中，水培７ｄ后葉片可用于白粉病的傳代培養(yǎng)或切割為離體葉片。水培液配方：尿素５００ｇ、磷酸二氫鉀３００ｇ、硫酸鈣１００ｇ、硫酸鎂５０ｇ、硫酸鋅０．１ｇ、硫酸亞鐵０．３ｇ、硫酸銅０．１ｇ、硫酸錳０．３ｇ、硼酸０．２ｇ、水１０００Ｌ。

１．１．２ 室內(nèi)培養(yǎng)的小麥白粉病菌孢子粉 水培７ｄ后的小麥葉片進(jìn)行白粉病菌接種。接種方法為直接將白粉病菌孢子粉抖落到植株上，接種白粉病菌孢子后的小麥苗繼續(xù)培養(yǎng)。４ｄ后葉片表面可見點(diǎn)狀的淺色菌斑，再經(jīng)過３ｄ培養(yǎng)，小麥葉片上便產(chǎn)生大量分生孢子。培養(yǎng)條件：溫度（２０±１）℃，相對(duì)濕度４５％～６５％，光照１４ｈ／ｄ，光源為日光燈管組，光照度為３０００ｌｘ，光源距植物頂端３０～３５cm。

１．１．３ 溶劑及標(biāo)準(zhǔn)樣品 溶劑為市售分析純化學(xué)試劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯；殺菌劑（抗真菌劑）標(biāo)準(zhǔn)樣品為市售分析純化學(xué)試劑嘧菌酯、咪鮮胺。

１．１．４ 放線菌液體搖瓶發(fā)酵提取物 放線菌液體搖瓶發(fā)酵提取物由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心制備，提取溶劑為乙酸乙酯和甲醇。

１．１．５ 主要儀器和設(shè)備 Ｂ１００－１Ｆ蠕動(dòng)泵、ＨＤ－１３０美術(shù)噴筆、ＭＣＥ８ｋ電子移液器、ＤＶ８－２００移液器、人工氣候室（光溫濕可調(diào)）、２４孔組織培養(yǎng)板。

１．２ 試驗(yàn)方法

１．２．１ 葉片處理及不同溫度小麥離體葉片的保鮮試驗(yàn) 預(yù)先在２４孔組織培養(yǎng)板中加入３ｇ／Ｌ熱瓊脂溶液［１］，每孔加入量為１．２ｍＬ，冷卻備用。小麥葉片采下后用打孔器切取長(zhǎng)為８ｍｍ的離體葉片（葉切片），葉切片轉(zhuǎn)入２４孔組織培養(yǎng)板中。葉片背面向上，葉片正面緊貼培養(yǎng)板中已經(jīng)冷卻的瓊脂。試驗(yàn)設(shè)３個(gè)培養(yǎng)溫度（１６、２０、２５℃），比較小麥離體葉片在２４孔組織培養(yǎng)板中的保鮮時(shí)間。

１．２．２不同溫度、濕度對(duì)小麥白粉病發(fā)病影響試驗(yàn) 采用直接接種小麥白粉病菌孢子的方法進(jìn)行試驗(yàn)［２］。試驗(yàn)設(shè)３個(gè)培養(yǎng)溫度（１６、２０、２５℃）和２個(gè)濕度環(huán)境（相對(duì)濕度４５％～６５％、１００％），水培７ｄ的小麥苗接種白粉病菌，記錄不同溫度、濕度條件下小麥白粉病發(fā)病情況。

１．２．３ 小麥白粉病菌孢子在離體葉片上的侵染試驗(yàn) 直接將小麥白粉病菌孢子均勻抖落接種在離體葉片上，記錄小麥白粉病在離體葉片上的病情發(fā)展［３］。同時(shí)以與離體葉片同生長(zhǎng)期的水培苗為參照。每組參照用苗２０株，接種時(shí)葉片背面向上，并標(biāo)明有效接種范圍。水培苗葉片與離體葉片同時(shí)接種，保證各組葉片接種孢子量相同。接種后的１２塊２４孔組織培養(yǎng)板隨機(jī)分為３組在３個(gè)不同溫度（１６、２０、２５℃）培養(yǎng)，每個(gè)處理４個(gè)２４孔組織培養(yǎng)板９６個(gè)離體葉片。在光照和濕度相同的不同溫度的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄小麥白粉病在離體葉片上的病情發(fā)展。在菌斑出現(xiàn)后，隨機(jī)從各離體葉片組選?。玻捌ǎ玻岸稳~切片）離體葉片，統(tǒng)計(jì)葉片上病斑數(shù)；同時(shí)在參照組每株選?。倍渭s８ｍｍ長(zhǎng)的葉片，統(tǒng)計(jì)葉片上病斑數(shù)。培養(yǎng)條件為光照度３０００ｌｘ，相對(duì)濕度４５％～６５％。

１．２．４ 抗真菌劑離體葉片法室內(nèi)生測(cè)穩(wěn)定性試驗(yàn)［４］ 對(duì)２個(gè)抗真菌劑標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行篩選穩(wěn)定性試驗(yàn)，按目測(cè)分級(jí)法進(jìn)行分級(jí)［５］。標(biāo)準(zhǔn)樣品以０．０５０ｍｇ／ｍＬ為最高濃度，二倍法稀釋為１２個(gè)梯度濃度?？瞻讓?duì)照２組：第一組以乙醇－無(wú)菌水（體積比１∶１００）處理，另一組為無(wú)菌水處理。試驗(yàn)分２種方法進(jìn)行。方法一為預(yù)防活性。?。保埃唉蹋鐦悠啡芤哼M(jìn)行噴霧，待葉片表面浮水干后接種白粉病菌孢子；方法二為治療活性，先在小麥植株上接種白粉病菌孢子培養(yǎng)４ｄ，葉片上初現(xiàn)淺色菌斑時(shí)切取８ｍｍ葉片移入２４孔組織培養(yǎng)板中，葉片背面向上，葉片正面緊貼培養(yǎng)板中已經(jīng)冷卻的瓊脂，?。保埃唉蹋鐦悠啡芤簢婌F后繼續(xù)培養(yǎng)１０ｄ檢查，根據(jù)每孔病斑數(shù)對(duì)測(cè)定物的殺菌活性進(jìn)行分級(jí)。每個(gè)濃度設(shè)２個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件為溫度（２０±１）℃，相對(duì)濕度４５％～６５％，光照時(shí)間１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距２４孔組織培養(yǎng)板５０～６０cm。

１．２．５ 放線菌搖瓶發(fā)酵提取物的篩選試驗(yàn) ?。保恚碳状技尤胧⒂刑崛∥锏臉悠饭苤?，待提取物充分溶解后移入預(yù)先稱重的１ｍＬ塑料樣品管中，重新干燥后稱重（精確到０．１ｍｇ）。根據(jù)樣品量加入溶劑（乙醇，分析純），每毫克樣品加入溶劑量為０．１ｍＬ，超聲波振蕩１０ｍｉｎ后用無(wú)菌水稀釋。定容提取物最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬ。樣品設(shè)３個(gè)梯度濃度，分別為０．０３０、０．０１０、０．００３ｍｇ／ｍＬ，?。埃保恚倘芤哼M(jìn)行噴霧。待葉片表面浮水干后接種小麥白粉病菌孢子。培養(yǎng)１０ｄ后檢查，根據(jù)每孔病斑數(shù)對(duì)測(cè)定物的殺菌活性進(jìn)行分級(jí)。每個(gè)濃度設(shè)２個(gè)重復(fù)，僅對(duì)２個(gè)重復(fù)顯示結(jié)果不一致的進(jìn)行復(fù)篩。培養(yǎng)條件為溫度（２０±1）℃，相對(duì)濕度４５％～６５％，光照時(shí)間１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距組織培養(yǎng)板５０～６０cm。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 不同溫度小麥離體葉片的保鮮效果

因在２４孔組織培養(yǎng)板中離體葉片用瓊脂保濕并加蓋，在各孔室小環(huán)境中濕度能保持在飽和狀態(tài)，所以試驗(yàn)只針對(duì)環(huán)境溫度進(jìn)行比較。處理７ｄ和１４ｄ的試驗(yàn)結(jié)果（表１）表明，在１６℃和２０℃溫度下，葉片可以保鮮１４ｄ，綜合溫度對(duì)小麥離體葉片和小麥白粉病菌孢子的影響，確定２０℃為篩選適宜溫度。

２．２ 溫度、濕度對(duì)小麥白粉病發(fā)病的影響

２．３ 不同溫度對(duì)侵染的影響

２．４ 抗真菌劑離體葉片法室內(nèi)生測(cè)穩(wěn)定性

２．５ 放線菌搖瓶發(fā)酵提取物離體葉片法篩選結(jié)果

隨機(jī)選?。矗福皞€(gè)放線菌液體搖瓶發(fā)酵提取物進(jìn)行室內(nèi)離體葉片法篩選，獲得活性提取物１２個(gè)。目前篩選工作還在繼續(xù)。

３ 討論

小麥白粉病的離體葉片篩選法是在葉片噴霧法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過微型化而形成的一種高通量、高敏感度的室內(nèi)篩選方法，這種方法適合于產(chǎn)量低、組分多的微生物源先導(dǎo)化合物的篩選。小麥白粉病室內(nèi)培養(yǎng)及人工接種技術(shù)突破了季節(jié)、氣候等諸多環(huán)境因素的限制，使長(zhǎng)年進(jìn)行有效篩選成為可能。由于離體葉片與大田小麥在生理代謝、生態(tài)環(huán)境等方面存在差異，對(duì)樣品的活性反應(yīng)差異性有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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［５］ＧＢ／Ｔ１７９８０．２２—２０００，農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）殺菌劑防治禾谷類白粉?。郏樱荩?/p>