張江　李 嘯　杜浪

摘要：對基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，首先通過單因素試驗，挑選出對菌株產(chǎn)酶有較大影響的因子及濃度范圍，再通過兩水平析因試驗和最陡爬坡試驗確定顯著影響因子和濃度拐點，最后采用響應(yīng)面分析法確定得到培養(yǎng)基成分的最佳配比為：甘油 10.74 g·L-1，酵母提取物51.85 g·L-1，酵母蛋白胨10 g·L-1，磷酸氫二鉀22.82 g·L-1，磷酸二氫鉀2.85 g·L-1。與原始培養(yǎng)基生產(chǎn)水平相比，采用優(yōu)化培養(yǎng)基后，酶活提高了48.4%。

關(guān)鍵詞：基因工程；大腸桿菌；α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；最陡爬坡試驗；響應(yīng)面設(shè)計

中圖分類號： Q936 文獻標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.018

環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡稱CD）是由直鏈淀粉經(jīng)酶解環(huán)合后得到的由6個以上葡萄糖連結(jié)而成的環(huán)狀低聚化合物。環(huán)糊精具有獨特的環(huán)狀中空圓筒型的立體結(jié)構(gòu)，與客體分子形成包合物后可有效地改善客體分子的物理化學(xué)性質(zhì)，因此，環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種基因工程大腸桿菌由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2試 劑酵母浸出物（FM818，簡稱YE）由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；其它試劑均為分析純AR。

1.2方 法

1.2.1種子培養(yǎng)將斜面菌接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37 ℃和轉(zhuǎn)速為200 r·min-1回轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)8 h。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)取5 mL種子液接入裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃和轉(zhuǎn)速為200 r·min-1回轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)36 h。

1.2.5菌體量測定取發(fā)酵液用適量蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，振蕩均勻后，用可見光分光光度計于600 nm處測量其光吸收值（OD600）。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基單因素試驗與結(jié)果

本研究在碳源方面考察了甘油濃度，并考察了3種復(fù)合氮源。由表1可知，當(dāng)甘油濃度為9 g·L-1時，菌體濃度和酶活力均達到最大。YE濃度增加，對菌體濃度的增長有正向促進作用，但對酶活力增長不利；同時，在有牛骨蛋白胨的條件下，酶活力顯著增加。在僅有牛骨蛋白胨的條件下，酶活力的表現(xiàn)與牛骨蛋白胨濃度呈正相關(guān)。橫向與酵母蛋白胨的影響進行比較，牛骨蛋白胨對菌體濃度和酶活力的促進作用顯得不足。隨著復(fù)合磷酸鹽濃度的增加，菌株產(chǎn)酶出現(xiàn)明顯的增長，并在28.55 g·L-1時達到最高，說明環(huán)境pH值對菌株產(chǎn)酶有較大影響。

2.3驗證試驗

3結(jié)論

由試驗得知，甘油、酵母浸出物、酵母蛋白胨、復(fù)合磷酸鹽對基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶有一定影響。通過兩水平析因試驗分析，甘油和酵母浸出物是顯著影響因子。對這二者進行響應(yīng)面設(shè)計，通過軟件分析，得到培養(yǎng)基成分的最佳配比為：甘油為10.74 g·L-1，酵母浸出物FM818為51.85 g·L-1，酵母蛋白胨FP101為10 g·L-1，磷酸氫二鉀為22.82 g·L-1，磷酸二氫鉀為2.85 g·L-1 。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行驗證試驗，與原有培養(yǎng)基相比，酶活值提高了48.4%。本研究為α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有一定指導(dǎo)作用。

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