張麗萍　查仁明　李尚偉

摘要：介紹了Bt基因及轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的作用機理，綜述了轉(zhuǎn)Bt基因水稻的研究概況，分析了轉(zhuǎn)Bt水稻的生物安全性，并展望了Bt水稻的發(fā)展趨勢，以期為Bt水稻的安全性評價及大規(guī)模商業(yè)化種植提供參考。

關(guān)鍵詞：水稻；Bt基因；轉(zhuǎn)基因；抗蟲

中圖分類號： S511 文獻標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2012.06.003

水稻（Oryza sativa） 是世界上最重要的糧食作物之一，全球近半數(shù)人以稻米為食。2001─2025年，世界對水稻的需求量大致每年增加1%，相當(dāng)于這一時期亞洲人口的增長率。世界上水稻的種植范圍很廣，其中中國是最大的產(chǎn)稻國，其水稻產(chǎn)量占世界稻米總產(chǎn)量的1/3[1]，因此，水稻種植帶來的產(chǎn)值在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的位置。與此同時，水稻同樣也是受到害蟲侵害最為嚴(yán)重的農(nóng)作物之一[2]。長期以來，為害我國水稻的主要害蟲有螟蟲（稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟）和稻飛虱，主要病害有稻瘟病、白葉枯病、紋枯病等[3]，每年因蟲害造成水稻產(chǎn)量損失約為10%[4]。在過去的幾十年中，化學(xué)防治一直是水稻害蟲防治的主要方法，但在減輕害蟲危害、提高水稻產(chǎn)量的同時也產(chǎn)生了新的問題?；瘜W(xué)殺蟲劑的長期使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染、生態(tài)的失衡、生產(chǎn)成本提高、水稻品質(zhì)下降以及害蟲本身產(chǎn)生抗藥性等問題。隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，有大量文獻報道，培育自身具有高抗蟲性的水稻已成為現(xiàn)實[5-9]。

1Bt基因及轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的作用機理

1.1Bt基因的簡介

Bt基因即蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）基因，由于其具有殺蟲效果好、安全性高、高效等優(yōu)點，已成為現(xiàn)今世界上應(yīng)用最為廣泛和最有應(yīng)用前景的抗蟲基因。首次發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌是在1902年，發(fā)現(xiàn)該菌的學(xué)者是日本生物學(xué)家Shigetane Ishiwatari；再次分離出該桿菌是在1911年的德國蘇云金省，分離出該桿菌的學(xué)者是Ernst Berline，并將該菌命名為蘇云金芽胞桿菌[10-11]。蘇云金芽孢桿菌是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，其主要的殺蟲活性成分——殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal proteins， ICP），也稱為δ-內(nèi)毒素，是蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成過程中產(chǎn)生的。典型的ICP由兩部分組成，N端的活性片段和C端的結(jié)構(gòu)片段，編碼殺蟲晶體蛋白的基因通稱為Bt或Cry基因。許多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性，由Crickmore等人組成的Bt基因命名委員會在1995年召開的無脊椎動物病理會年會上提出了以殺蟲蛋白氨基酸序列同源性為唯一標(biāo)準(zhǔn)的分類命名體系。同源性在45%以下，為第一等級，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性在45%～78%之間，為第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78%～95%之間，為第三等級，用小寫英文字母表示；同源性在95%以上，為第四等級，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，例如Cry1Aa1基因[12]。自1981年Schnepf等[13]首次克隆出Cry （crystal protein gene）基因以來，新的Bt基因不斷地被發(fā)現(xiàn)，截止2012年8月，Bt基因已達到73個大類，總計667個基因序列[14]。這些殺蟲晶體蛋白可作用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等靶標(biāo)昆蟲和線蟲，還能溶解細(xì)胞。

1.2轉(zhuǎn)Bt基因水稻的抗蟲機理

經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt毒蛋白導(dǎo)入水稻后，一般認(rèn)為Bt毒蛋白的作用過程要經(jīng)溶解、酶解活化、與受體結(jié)合、插入和孔洞或離子通道的形成5個環(huán)節(jié)[15]。研究表明，Bt毒蛋白可溶解于pH值大于12或pH值小于9.5并加有巰基試劑的堿性溶液中[16]。鱗翅目昆蟲幼蟲中腸的pH值呈堿性，有利于Bt毒蛋白的溶解，這也是蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目昆蟲有高效毒殺作用的原因之一。Bt毒蛋白的重要殺蟲成分ICP自身沒有生物活性，又名原毒素（protoxin） ，通過昆蟲的取食可在昆蟲中腸的堿性環(huán)境中被溶解，溶解的Bt毒蛋白被中腸蛋白酶水解為毒素核心肽段，這些活力肽段能與中腸上皮的特異性受體專一性結(jié)合，進而毒蛋白插入細(xì)胞膜中形成孔洞或離子通道，使膜的完整性遭到破壞，引起細(xì)胞滲透失衡，細(xì)胞膨脹并溶解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。

對Bt毒蛋白導(dǎo)致害蟲死亡的組織病理學(xué)研究表明，二化螟5齡幼蟲取食轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ab）基因抗蟲水稻后，中腸上皮細(xì)胞中的細(xì)胞器會發(fā)生很大的變化，如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)會發(fā)生明顯變化，在病變的過程中會出現(xiàn)粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹和核糖體脫落等現(xiàn)象。與對照相比，取食Bt水稻后的二化螟幼蟲腸道內(nèi)弱堿性類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的活性呈下降趨勢，而強堿性類胰蛋白酶的活性則呈上升趨勢[17]。在正常的稻縱卷葉螟3齡和5齡幼蟲腸道內(nèi)，中腸上皮柱狀細(xì)胞頂部的微絨毛數(shù)量比較多，細(xì)胞質(zhì)均勻， 細(xì)胞器豐富。當(dāng)這些稻縱卷葉螟幼蟲取食Bt水稻后，柱狀細(xì)胞的微絨毛有脫落現(xiàn)象，且隨著取食時間的增加，中腸上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)透明化，細(xì)胞器的數(shù)量減少[18]。

2轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻概況

轉(zhuǎn)基因水稻是繼轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜等之后又一個備受國際重視且發(fā)展顯著的產(chǎn)業(yè)。轉(zhuǎn)Bt基因水稻是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白基因作為外源基因?qū)胨精@得的，對鱗翅目害蟲（如稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟等）具有良好的抗性[19]。雖然發(fā)現(xiàn)了上百種Bt基因，但是僅有很小的部分被導(dǎo)入水稻中進行抗蟲性測定。轉(zhuǎn)Bt基因水稻最初常以Cry1A類為主，如Cry1Ab、Cry1Ac、融合基因Cry1A（b）/Cry1A（c）[20]等，現(xiàn)在Bt抗蟲水稻無論從方法上還是成果上均已取得了巨大進展。

自20世紀(jì)80年代中期以來，研究人員運用不同的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了不同種類的Bt抗蟲水稻。楊虹等[5]報道了通過聚乙二醇（PEG）法將Bt基因?qū)胨?，謝道昕等[21]通過花粉管通道技術(shù)把Bt基因成功地導(dǎo)入水稻中，F(xiàn)ujimoto等[7]采用電激法將通過修飾的Cry1Ab基因?qū)刖荆状蔚玫搅烁弑磉_Bt蛋白的水稻植株，具有良好的抗蟲性。Wünn、Ghareyazie、許新萍等研究者分別利用基因槍法將Bt基因成功地導(dǎo)入水稻中獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且抗蟲性較好[8，22-24]；Chan、Cheng、項友斌等分別報道了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Bt基因?qū)胨荆@得了可育的、抗蟲性良好的轉(zhuǎn)基因植株[9，25-28]。隨著水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷成熟，基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成為目前轉(zhuǎn)基因水稻中常用的兩種方法。

隨著對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)單價Cry1A類抗蟲水稻植株的抗蟲譜單一，害蟲對轉(zhuǎn)基因植株耐受性增強。為了解決這些問題，并且使水稻能夠高抗和多抗，增強Bt水稻的抗蟲性，國內(nèi)外的研究者們開始試驗運用除Cry1A類以外的其它基因，隨后陸續(xù)報道了運用經(jīng)人工改造合成的Bt抗蟲基因，如用改造的Cry2A、Cry1B、Cry1C等培育的對水稻螟蟲具有不同程度抗性的水稻[29-34]。同時，協(xié)同轉(zhuǎn)化兩個或多個抗性基因的研究也在進行，如Maqbool等[35]首次將Cry1Ac和Cry2A兩個Bt基因轉(zhuǎn)入水稻中；Bashir等[36]將Cry1Ac和Cry2A協(xié)同導(dǎo)入秈稻中，得到的轉(zhuǎn)雙價基因植株對三化螟和稻縱卷葉螟具有高抗性。衛(wèi)劍文等[32]采用基因槍法把Bt基因Cry1Ab與大豆胰蛋白酶抑制劑基因（SBTi）共同導(dǎo)入到優(yōu)良秈稻中，獲得的植株對稻縱卷葉螟的抗蟲性增強，李永春等[37]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把雙價抗蟲基因Cry1Ac和CpTi（豇豆胰蛋白酶抑制劑）轉(zhuǎn)入粳稻中，得到了對二化螟高毒性的植株。中國科學(xué)院Huang等[38]得到了轉(zhuǎn)Cry1Ac和經(jīng)修飾的CpTi 雙價基因水稻，對大螟、二化螟以及稻縱卷葉螟有高抗性，已進入環(huán)境釋放階段。沈志成等[39]將融合Cry1Ab /vip3基因?qū)胨?，得到對二化螟和稻縱卷葉螟抗性良好的植株，馮道榮等[40]首次運用基因槍法把含有多個抗蟲抗病基因（Bt+pinII+bar）的載體轉(zhuǎn)入水稻，并得到了既抗蟲又抗病的植株。Maqbool[41]在2001年又研究了轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2A+gna三價基因的秈稻，結(jié)果表明它們對水稻害蟲的抗性顯著，Ramesh等[42]把人工合成的Cry1Ab /Cry1Ac 融合基因和gna基因一同轉(zhuǎn)入秈稻，獲得的轉(zhuǎn)基因株系對鱗翅目和同翅目害蟲均表現(xiàn)出顯著抗性。

全球轉(zhuǎn)基因水稻的研究發(fā)展迅速，實驗中應(yīng)用最為成功的抗蟲基因是對鱗翅目害蟲有顯著控制作用的Bt基因。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻是當(dāng)前研究最為成熟和最接近實現(xiàn)商品化的轉(zhuǎn)基因水稻品種之一[43]。2000年以來，美國先后批準(zhǔn)6個抗除草劑和藥用轉(zhuǎn)基因水稻，伊朗批準(zhǔn)了1個轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商品化種植；加拿大、墨西哥、澳大利亞、哥倫比亞這4國批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因水稻進口，允許食用[44]。2009年，我國為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系‘華恢1號和‘Bt汕優(yōu)63發(fā)放了安全證書，它們是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的高抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因水稻?？茖W(xué)家將人工改造合成的Bt殺蟲蛋白融合基因Cry1Ab/Cry1Ac轉(zhuǎn)入水稻恢復(fù)系‘明恢63，培育出抗蟲水稻‘華恢1號。中國是世界上第三個批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的國家，將成為世界上種植轉(zhuǎn)基因水稻面積最大的國家。

3轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的安全性

水稻作為百姓的主糧，它的產(chǎn)業(yè)發(fā)展一直備受人們的關(guān)注和重視。轉(zhuǎn)基因水稻的出現(xiàn)，可以減少水稻病害蟲的發(fā)生，減少農(nóng)藥用量和環(huán)境污染，節(jié)省投入成本，解決人類糧食緊張問題。Bt作為外源基因?qū)胨舅a(chǎn)生的安全性問題已成為社會廣泛關(guān)注的熱點。轉(zhuǎn)Bt基因水稻的安全性包括食品安全和生態(tài)安全。轉(zhuǎn)基因稻米是人們直接食用的產(chǎn)品，關(guān)系到人類的生命健康和安全。鱗翅目害蟲等靶標(biāo)昆蟲的中腸上皮細(xì)胞含有Bt蛋白的特異性受體，而人類腸道上皮細(xì)胞沒有該蛋白的結(jié)合位點，因此Bt蛋白不會對人造成傷害。在營養(yǎng)學(xué)評價方面，轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账驹谥饕煞?、微量營養(yǎng)成分以及抗?fàn)I養(yǎng)因子等方面都沒有生物學(xué)意義上的差異。在毒理學(xué)評價方面，轉(zhuǎn)基因稻米對大鼠進行90 d喂養(yǎng)試驗、慢性毒性試驗，結(jié)果表明Bt稻米對哺乳動物是安全的[45]。

轉(zhuǎn)Bt基因水稻的生態(tài)安全性也是人類關(guān)注的問題，轉(zhuǎn)基因水稻的種植是否會產(chǎn)生基因漂流，以及是否會對非靶標(biāo)性昆蟲、生物多樣性以及土壤環(huán)境等造成影響都需要進一步深入研究?，F(xiàn)有的研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻對稻田生態(tài)系統(tǒng)是安全的；Bt水稻對稻田節(jié)肢動物群落影響明顯弱于化學(xué)殺蟲劑，用Bt水稻防治害蟲比用化學(xué)殺蟲劑更有利于保持稻田生物群落的穩(wěn)定性和保護稻田中害蟲的天敵。轉(zhuǎn)Bt基因水稻對土壤微生物和酶活性有一定的影響，關(guān)于這方面的研究應(yīng)該在不同生態(tài)區(qū)開展長期的定位監(jiān)測和評價。Bt水稻對人類、環(huán)境、生態(tài)的安全性還需要多層次、多角度地進行深入和持久的研究。

4展望

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻經(jīng)過20多年的發(fā)展，已碩果累累且前景廣闊。在生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，應(yīng)力爭走在轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng)域的最前沿。面對人口眾多的基本國情，我們在保證糧食產(chǎn)量的同時要保證糧食安全。

目前，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成熟，但距大規(guī)模運用遺傳工程技術(shù)改良水稻品種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻還有遙遠(yuǎn)的距離。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻雖然在安全性研究方面已取得了一定成就，但還存在許多未知領(lǐng)域。因此，加快建立關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻安全性評價體系的標(biāo)準(zhǔn)是一項刻不容緩的工作。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻為防治害蟲提供了一條經(jīng)濟便捷的途徑，它必將帶來大規(guī)模的商品化種植，然而對它的安全性還需要從對人類、環(huán)境和生態(tài)等方面進行長期和深入的研究。

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