牛慶偉 孔秋生 黃遠(yuǎn) 別之龍

摘 要： 細(xì)菌性果斑?。˙FB）是西瓜上的毀滅性病害，西瓜嫁接苗集約化生產(chǎn)過程中容易感染該病害，研究嫁接過程中BFB的侵染途徑及防治方法對(duì)于西瓜健康種苗生產(chǎn)具有重要意義。本研究通過人工模擬接種西瓜細(xì)菌性果斑病菌pslbtw20，分析了用帶菌竹簽嫁接對(duì)西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的影響，同時(shí)研究了不同消毒技術(shù)的效果。結(jié)果表明，高濃度菌源污染的竹簽嫁接能夠?qū)е录藿用鏐FB的發(fā)生，嫁接前采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡帶菌嫁接用具15 min，防效可達(dá)到100%。

關(guān)鍵詞： 嫁接工具； 竹簽； 細(xì)菌性果斑?。?消毒技術(shù)； 西瓜嫁接苗

西瓜細(xì)菌性果斑?。˙acterial Fruit Blotch）是由燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenae subsp. citrulli）引起的瓜類細(xì)菌性果腐病，簡(jiǎn)稱BFB，是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，也是我國(guó)規(guī)定的檢疫性病害之一。BFB從苗期到成株期均可發(fā)生，病菌可危害瓜類植物的葉子和果實(shí)，引起葉枯和瓜腐，但葉柄、莖、根不受浸染[1]。BFB病菌主要附著在種子和病株殘?bào)w上越冬，種子帶菌為主要侵染來源，病菌隨風(fēng)、雨或灌溉水從植株氣孔或傷口侵入，在病株上大量繁殖擴(kuò)展， 造成再次侵染[2]。

BFB于1985年在我國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，目前該病在我國(guó)各西瓜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。隨著西瓜集約化嫁接育苗技術(shù)的普及，越來越多的育苗工廠開始出現(xiàn)BFB的發(fā)生與流行。BFB對(duì)嫁接苗會(huì)造成毀滅性的危害，其所造成的損失和影響遠(yuǎn)比其他瓜類病害嚴(yán)重。因此，研究嫁接苗生產(chǎn)過程中BFB的侵染途徑及其防治方法，對(duì)保護(hù)瓜農(nóng)、育苗生產(chǎn)者的利益和防控西瓜BFB的發(fā)生與流行具有重要意義。

嫁接過程中嫁接苗的傷口、污染的刀具和器皿及人為的傳播均會(huì)造成病害的流行[3]。Bahar等[4]發(fā)現(xiàn)在甜瓜1葉1心期，莖部人工針刺接種BFB病菌，會(huì)導(dǎo)致甜瓜幼苗發(fā)生BFB，最終腐爛死亡。在西瓜嫁接過程中，需使用竹簽等嫁接工具在砧木上斜插，這也相當(dāng)于一個(gè)接種過程。然而，如果竹簽等嫁接工具帶有病原菌，會(huì)不會(huì)造成嫁接苗BFB的發(fā)生，目前尚不知曉。本研究的主要目的是利用人工接種的方法，分析用帶菌竹簽嫁接與西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的關(guān)系，尋找高效嫁接用具消毒技術(shù)，旨在為西瓜嫁接苗健康生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

砧木和接穗分別選用京欣砧1號(hào)（北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心提供）和早佳（84-24，新疆明鑫科鴻農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供）。 西瓜細(xì)菌性果斑病菌為pslbtw20，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所趙廷昌研究員惠贈(zèng)。供試培養(yǎng)基為KBA培養(yǎng)基（硫酸鎂1.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、瓊脂20 g、甘油10 g、蛋白胨20 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.2）。嫁接竹簽由武漢洪北種苗有限公司提供。試驗(yàn)于2012年3月15日至5月1日在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑室內(nèi)抑菌和殺菌試驗(yàn) 挑選西瓜細(xì)菌性果斑病菌pslbtw20的單菌落，在KBA液體培養(yǎng)基中28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)，制成菌量約為108 cfu·mL-1的菌懸液。分別用40% 甲醛50倍液、75% 酒精進(jìn)行西瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑菌和殺菌試驗(yàn)。抑菌作用采用紙碟法進(jìn)行測(cè)定[5]，殺菌效果測(cè)定按照趙廷昌的方法進(jìn)行[6]，處理BFB病菌的時(shí)間分別為5、10、15 min。

1.2.2 竹簽接菌濃度與西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的關(guān)系 選用濃度為108、107、106、105、104 cfu·mL-1的菌懸液，采用人工蘸取菌懸液的方法對(duì)竹簽接菌，無菌水為對(duì)照。嫁接方法均采用頂插接[7]，嫁接竹簽蘸1次菌液嫁接1株西瓜苗，共6個(gè)處理，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18株。在溫室中生長(zhǎng)10 d，每天記錄嫁接苗發(fā)病率，觀察嫁接苗發(fā)病情況。

1.2.3 確定嫁接苗子葉期發(fā)病情況的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)嫁接苗發(fā)病情況并參考Hopkins and Thompson[8]提出的1～9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，確定竹簽帶菌時(shí)嫁接苗子葉期發(fā)病情況分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，用于計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.4 帶菌竹簽嫁接與西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的關(guān)系 在育苗工廠的嫁接過程中，竹簽需要連續(xù)嫁接作業(yè)，所以有必要模擬帶菌竹簽在育苗工廠中對(duì)嫁接苗的危害情況。選用108 cfu·mL-1左右的菌懸液，嫁接竹簽蘸取菌液1次，然后按順序連續(xù)嫁接50株西瓜苗（1個(gè)穴盤），重復(fù)3次，以不帶菌嫁接竹簽為對(duì)照。每天調(diào)查嫁接苗發(fā)病率并計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)參考Amadi等[9]的計(jì)算公式：

1.2.5 帶菌竹簽消毒技術(shù)對(duì)西瓜嫁接苗BFB的防治效果 選用108 cfu·mL-1左右的菌懸液，采用人工蘸取菌懸液的方法對(duì)竹簽接菌，分別用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡15 min 消毒，消毒后按順序連續(xù)嫁接50株西瓜苗，以帶菌竹簽嫁接處理作為對(duì)照，共3個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。第10天調(diào)查每株嫁接苗的病情指數(shù)和發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種消毒液對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的室內(nèi)抑菌和殺滅效果

室內(nèi)應(yīng)用圓形濾紙法測(cè)定結(jié)果表明，40% 甲醛50倍液對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌有顯著抑菌作用，抑菌圈直徑為16.6 mm，75% 酒精對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌無抑菌作用。室內(nèi)殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，40% 甲醛50倍液和75% 酒精分別處理西瓜細(xì)菌性果斑病菌，無論是處理5、10 min，還是15 min，KBA固體培養(yǎng)都無單菌落存在，殺菌效果達(dá)到100%。

2.2 不同帶菌濃度竹簽嫁接對(duì)西瓜嫁接苗BFB發(fā)病率的影響

竹簽不同帶菌濃度下西瓜嫁接苗BFB發(fā)病率見圖1。當(dāng)嫁接竹簽帶菌濃度為104 cfu·mL-1時(shí)，西瓜嫁接苗在嫁接后 10 d內(nèi)未發(fā)生BFB，與對(duì)照無差異；當(dāng)帶菌濃度為105 cfu·mL-1時(shí)，嫁接后第7 天開始發(fā)病，第10天發(fā)病率達(dá)到40.7%；當(dāng)帶菌濃度為106、107、108 cfu·mL-1時(shí)，嫁接苗在嫁接后第3天開始發(fā)病，第9天發(fā)病率達(dá)到100%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，帶菌竹簽嫁接能夠?qū)е录藿用绨l(fā)生BFB，并且?guī)Ь鷿舛仍礁撸“Y出現(xiàn)的時(shí)間就越早，而且發(fā)病程度也越嚴(yán)重。

2.3 子葉期嫁接苗發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2.4 帶菌竹簽連續(xù)嫁接對(duì)西瓜嫁接苗BFB發(fā)生的影響

帶菌竹簽連續(xù)嫁接50株西瓜苗，嫁接苗BFB發(fā)病率和病情指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化見圖3。嫁接苗從第3 天開始發(fā)病，接穗子葉早期出現(xiàn)水漬狀病斑，后期逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚珘乃啦“?，接穗莖部出現(xiàn)褐色病斑條紋，病情嚴(yán)重的導(dǎo)致嫁接苗接穗腐爛枯死，病情指數(shù)和發(fā)病率隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷加重，第8天嫁接苗發(fā)病率達(dá)97.3%，第10天嫁接苗病情指數(shù)達(dá)到88.4，對(duì)照嫁接苗沒有發(fā)病。

嫁接10 d后，采集2株接穗子葉有明顯病斑的成活西瓜嫁接苗，嫁接苗病原菌分離結(jié)果見圖4。不帶菌濃度竹簽嫁接處理，嫁接苗嫁接部位、接穗莖和接穗子葉未能分離得到單菌落，但是在發(fā)病嫁接苗的這3個(gè)部位均能夠分離到單菌落，挑取疑似單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖5。在16個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，15個(gè)能夠擴(kuò)增到BFB細(xì)菌的特異性片段，片段長(zhǎng)度在250～500 bp，而2.5 竹簽消毒技術(shù)對(duì)西瓜嫁接苗BFB的防治效果

帶菌嫁接竹簽不同消毒技術(shù)對(duì)西瓜嫁接苗BFB的防效見表1。帶菌竹簽嫁接50株西瓜苗，嫁接后第10天嫁接苗發(fā)病率為97.3%，病情指數(shù) 88.4，40%。采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡帶菌竹簽15 min后嫁接西瓜苗，防效達(dá)到100%。可見，40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌竹簽15 min能夠有效防治竹簽帶菌所導(dǎo)致的嫁接苗染病，消毒效果徹底。

3 討 論

BFB危害在我國(guó)各西瓜產(chǎn)區(qū)均有報(bào)道，西瓜嫁接育苗場(chǎng)感染BFB是造成毀滅性危害的形式之一[12]。接穗種子帶菌是導(dǎo)致嫁接苗感染BFB的主要原因，通過集約化生產(chǎn)途徑使得BFB得以發(fā)生蔓延。本研究結(jié)果表明，帶菌竹簽嫁接能夠?qū)е录藿用绨l(fā)生BFB，并且?guī)Ь鷿舛仍礁?，病癥出現(xiàn)的時(shí)間就越早，而且發(fā)病程度也越嚴(yán)重。采用帶菌濃度為108 cfu·mL-1的竹簽連續(xù)嫁接50株西瓜苗，嫁接苗發(fā)病率達(dá)97.3%，病情指數(shù)達(dá)88.4。可見，在嫁接苗集約化生產(chǎn)過程中，被高濃度菌源污染的嫁接竹簽作為BFB病菌的傳播者，能夠?qū)е录藿用鏐FB 發(fā)生，對(duì)西瓜嫁接苗危害極其嚴(yán)重，研究帶菌嫁接工具對(duì)嫁接苗BFB發(fā)生的影響及其防治方法意義重大。

在嫁接苗BFB的發(fā)生與防治研究中，嫁接用具的消毒至關(guān)重要，韋志揚(yáng)[13]曾指出，要嚴(yán)格消毒嫁接用具，嫁接的刀具和器皿嫁接前用40% 甲醛50倍液浸泡10 min以上，馬凌珂等[14]指出嫁接用具需用75% 酒精溶液浸泡30 min，但是缺乏試驗(yàn)證明，目前尚未取得一致認(rèn)可。本研究采用40%甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌嫁接竹簽15 min，消毒處理后嫁接苗BFB發(fā)病率為0，消毒效果徹底。

嫁接時(shí)帶菌竹簽對(duì)砧木的斜插相當(dāng)于對(duì)嫁接苗嫁接部位人工接菌，嫁接部位的Aac如何侵染并導(dǎo)致嫁接苗發(fā)病，目前尚不知曉。前人研究結(jié)果表明，Aac有單根極生鞭毛，其鞭毛在侵染過程中有重要的作用，IV 型菌毛可幫助病菌定殖和在維管束導(dǎo)管中移動(dòng)[15]，BFB病菌能夠通過木質(zhì)部導(dǎo)管向下和向上移動(dòng)從而系統(tǒng)侵染甜瓜幼苗[4]。本研究結(jié)果表明，在發(fā)病嫁接苗的嫁接部位、接穗莖和接穗子葉中存在BFB病菌，接穗莖部出現(xiàn)褐色病斑條紋；由此推斷，在嫁接部位的BFB病菌可能通過接穗莖部木質(zhì)部導(dǎo)管侵染接穗子葉，BFB病菌可以系統(tǒng)侵染西瓜嫁接苗。

4 結(jié) 論

在西瓜嫁接苗的工廠化生產(chǎn)過程中，使用高濃度菌源污染的竹簽嫁接能夠?qū)е挛鞴霞藿用鏐FB的發(fā)生，對(duì)嫁接苗的危害極其嚴(yán)重，采用40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌嫁接竹簽15 min，對(duì)嫁接苗BFB防效達(dá)100%，消毒效果徹底。

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