孟 倩 趙旭宏 趙 瑾 雷 婷 張 曼
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床檢驗中心,北京 100038)
Ryden M等[1]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者脂肪丟失與脂肪降解增加密切相關(guān),不良的脂質(zhì)代謝狀態(tài)可能會降低疾病的生存率,并且減低患者對抗腫瘤治療的耐受性。因此本實驗對一種脂質(zhì)降解因子鋅α-2-糖蛋白(zincα-2-glycoprotein,ZAG)在消化道不同惡性腫瘤患者血清中的表達進行了研究,希望它能夠作為評價腫瘤患者脂代謝狀態(tài)的有效指標(biāo)。ZAG是一個相對分子質(zhì)量約43 000的單鏈糖蛋白,它作為一種脂解因子可以促進脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解,從而在許多腫瘤組織特別是惡病質(zhì)狀態(tài)中呈高表達[2],應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)ZAG在某些正常分泌上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有表達,其中包括乳腺、前列腺、肝臟、以及唾液腺、支氣管、胃腸道和汗腺上皮細(xì)胞。因此ZAG可以分泌進入多種體液中[3]。
本實驗對消化道常見腫瘤包括胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、肝癌患者及正常和良性對照組患者血清中的ZAG的表達進行了初步的鑒定,并對他們血清中脂代謝相關(guān)指標(biāo)進行了檢測,旨在探討這些腫瘤患者的脂質(zhì)代謝狀況與ZAG的關(guān)系。
實驗采集血清標(biāo)本進行研究和分析,癌癥患者組樣本胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、肝癌各6例,良性對照組樣本胃息肉、結(jié)腸息肉、直腸息肉、肝囊腫各6例,收集正常對照組樣本6例。所有標(biāo)本均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院,所有患者均經(jīng)過病理確診。患者年齡均大于45歲,既往體健。表1詳細(xì)列出了3組樣本的數(shù)量,各樣本的年齡性別及診斷。由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床檢驗中心在2 h內(nèi)對實驗中采集的新鮮血清標(biāo)本脂代謝相關(guān)指標(biāo)進行了檢測,具體應(yīng)用總膽固醇測定試劑盒(MERIT CHOICE),三酰甘油測定試劑盒(MERIT CHOICE),高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(SEKISUI),低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒(SEKISUI),對采集血清中的總膽固醇(total cholesterol,TC),三酰甘油(triglyceride,TG),高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDLC),低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)進行了檢測。
表1 患者信息列表Tab.1 Patients'information list(n=6)
血清標(biāo)本經(jīng)過定量后各取60 μg(總蛋白)上樣進行SDS-PAGE,電泳電壓60/120V。然后進行半干轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF膜上,12V恒壓轉(zhuǎn)膜100 min。之后用含5%脫脂奶粉的 PBST(含0.05%Tween的PBS)對膜進行封閉,時間2 h。最后用下列抗體進行蛋白免疫印跡分析:一抗為鼠源性抗ZAG單克隆抗體(Santa Cruz),β-actin單克隆抗體(Abcam),將抗體用封閉液分別以1∶100,1∶500稀釋,將膜置于抗體稀釋液中4度過夜。翌日PBST洗膜3次,每次20 min。之后進行二抗孵育,二抗為羊抗小鼠辣根過氧化酶抗體,抗體的稀釋濃度為1∶300,室溫下在搖床上孵育90 min后,PBST洗膜3次,每次15 min。之后應(yīng)用DAB增強顯色液對膜進行顯色。應(yīng)用Image J分析軟件對條帶吸光度進行鑒定。
采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,用方差分析對脂代謝相關(guān)指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C及 ZAG在胃病組(正常健康人,胃息肉,胃癌)、肝病組(正常健康人,肝囊腫,肝癌)、結(jié)腸疾病組(正常健康人,結(jié)腸息肉,結(jié)腸癌)、直腸疾病組(正常健康人,直腸息肉,直腸癌)中每組3個樣本血清中的含量做統(tǒng)計學(xué)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床檢驗中心對每種消化道惡性腫瘤及其相對應(yīng)的良性組患者和正常健康人血清中的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進行了檢測,具體檢測結(jié)果見表2。在肝病組、胃病組、結(jié)腸疾病組、直腸疾病組中,惡性組患者血清中的TC,TG,HDL-C,LDL-C與正常人和良性組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。
表2 正常組、良性組及癌癥組患者脂代謝指標(biāo)列表Tab.2 The index list for lipid metabolism(mmol/L)
實驗應(yīng)用蛋白免疫印跡的方法對所有樣本血清中ZAG的表達進行了鑒定(圖1)。以β-actin作為內(nèi)參對胃病組(正常健康人,胃息肉,胃癌)、肝病組(正常健康人,肝囊腫,肝癌)、結(jié)腸疾病組(正常健康人,結(jié)腸息肉,結(jié)腸癌)、直腸疾病組(正常健康人,直腸息肉,直腸癌)中每組ZAG表達的相對變化水平作了半定量分析,得到了ZAG在正常組和每種疾病組樣本中倍比變化的相對比率(圖2)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示在胃病組、結(jié)腸疾病組、直腸疾病組中,ZAG在惡性、良性和正常組3組間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.589,P=0.618,P=0.864)。而 ZAG在肝癌患者血清中的表達與正常健康人、良性組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013,P=0.008),但正常健康人與良性組患者比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.804)。
圖1 各樣本中ZAG相對表達Fig.1 Detection the relative expression level of ZAG in all serum samples ZAG:zinc-α-glycoprotein.
圖2 ZAG在各樣本組中的相對表達Fig.2 Relative expression level of ZAG in sample groups ZAG:zinc-α-glycoprotein.
脂質(zhì)代謝狀態(tài)對腫瘤患者的生存率具有重要影響,ZAG作為一種脂質(zhì)降解因子,它的表達增加與腫瘤患者惡病質(zhì)的發(fā)生有關(guān),因此對ZAG的檢測具有重要意義,它可能成為評價腫瘤病人脂質(zhì)代謝狀態(tài)的一個有價值的指標(biāo)。研究[4]顯示ZAG在多種生物過程中發(fā)揮作用,例如脂質(zhì)代謝、受精、抗原處理和提呈等,但它的功能尚未完全研究清楚。血清中的ZAG是肝臟產(chǎn)生分泌的,而精液中高含量的ZAG則來源于前列腺,脂肪細(xì)胞也能合成ZAG。除了血清和精液,在尿液、唾液、汗液、腦脊液等多種體液中都能夠檢測到這種蛋白[5]。目前關(guān)于ZAG在正常健康人和消化系統(tǒng)不同部位惡性腫瘤患者血清中的表達狀態(tài)比較的研究未見報道。
本實驗對消化系統(tǒng)惡性腫瘤包括胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌及相應(yīng)良性病組患者和正常健康人的血清中的ZAG含量做了初步鑒定;并對收集的所有樣本血清中的脂代謝相關(guān)指標(biāo) TC、TG、HDL-C、LDL-C進行了檢測。結(jié)果顯示在肝病組、胃病組、結(jié)腸疾病組,直腸疾病組患者血清中,TC、TG、HDL-C、LDL-C在正常健康人、良性病、惡性病組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在胃病組、結(jié)腸疾病組,直腸疾病組中ZAG的含量在惡性腫瘤組、良性病變組與正常組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而在肝病組中,肝癌患者血清中ZAG相對于正常健康人和肝囊腫表達增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所以我們推斷與實驗中檢測的其他消化道惡性腫瘤相比,ZAG在肝癌中的表達更具有臨床診斷意義。與CHOL、TG、HDL-C、LDL-C相比,它在評價肝癌患者脂代謝狀態(tài)方面可能更加靈敏。
[1]Rydén M,Agustsson T,Andersson J,et al.Adipose zinc-α2-glycoprotein is a catabolic marker in cancer and noncancerous states[J].J Intern Med,2012,274(4):414 -420.
[2]Bing C,Bao Y,Aenkins G,et al.Zinc-α2-glycoprotein,a lipid mobilizing factor,is expressed in adipocytes and is upregulated in mice with cancer cachexia[J].PNAS February,2004,101(8):2500 -2505.
[3]Tada T,Ohkubo I,Niwa M,et al.Immunohistochemical localization of Zn a2-glycoprotein in normal human tissues[J].J Histochem Cytochem,1991,39:1221 -1226.
[4]Hassan M I,Waheed A,Yadav S,et al.Zinc α2-glyco protein:a multidisciplinary protein[J].Mol Cancer Res,2008,6(6):892-906.
[5]Tada T,Ohkubo L,Niwa M,et al.Immunohistochemical localization of Zn-alpha2-Glycoprotein in normal human tissues[J].J Histochem Cytochem,1991,39(19):1221-1226.