楊 勇，牟婧男，丁亞萍，王俊霞，李健爽，杜曉燕*，常 東

(1.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，哈爾濱150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150001)

環(huán)境雌激素EEs(Environmental Estrogens)可通過污水、食品、藥品等進入到機體當中［1］，進而危害機體的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，并且可對腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生影響［2－3］。在各種環(huán)境雌激素中，甾類雌激素的危害較大［4］。雌二醇是一種甾類雌激素，有α、β兩種構型，其中17β－雌二醇生物活性最強。目前報道的雌二醇測定方法有高效液相色譜法［5］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［6］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［7］及各種免疫分析法［8－9］等?；诿庖叻磻碾娀瘜W傳感器，分析時間短、操作簡便且靈敏度較高，利于實現(xiàn)對樣品的實時、現(xiàn)場、在線測定。相比放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光免疫法(FIA)、化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)等免疫測定方法，電化學免疫傳感器是將抗體固定到電極表面，方便與未反應的雌二醇抗原分離，每次測定僅消耗幾微升的試劑和樣品，因此免疫傳感器在測定激素類物質(zhì)中具有很好的應用前景［10］。

蛋白A對抗體具有定向固定作用，能使抗體上與抗原決定簇發(fā)生結合的活性片段一致朝外［11］，避免了固定抗體取向的雜亂無章，可提高抗體的利用效率，并且蛋白A可避免抗體直接接觸金屬而失活。本研究選擇一次性絲網(wǎng)印刷電極作為基礎電極，印刷電極制作簡單方便、成本低、重復性好，最重要的是印刷電極可實現(xiàn)快速平行測定，更利于實際應用和商品化［12］。應用電化學法將納米金沉積在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，通過改變實驗參數(shù)有效地控制了納米顆粒的大小和密度。在納米金上固定蛋白A，通過蛋白A分子定向固定抗17β－雌二醇抗體。利用辣根過氧化物酶標記的雌二醇和樣品中的雌二醇與固定化抗體發(fā)生酶免疫競爭反應，測定樣品中17β－雌二醇含量。實驗結果表明以蛋白A為載體固定抗體后能夠很大地提高免疫反應的檢測靈敏度，且辣根過氧化物酶對硫堇－過氧化氫體系有很好的催化作用，酶底物產(chǎn)生靈敏的電流信號。尿液中雌二醇含量可反映機體對環(huán)境雌激素的接觸量，在臨床上測定內(nèi)源性雌激素有一定的意義，所以選擇人體尿液作為測定對象，研究表明該免疫傳感器對人尿液中雌二醇的測定結果較好。

1 實驗部分

1.1 儀器

CHI660A電化學工作站(上海辰華儀器公司);掃描電子顯微鏡－QUANTA200F(美國FEI公司);超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療器械一廠);高速離心機(上海安亭科學儀器廠);絲網(wǎng)印刷電極(南京天鼎生物技術研究所)。

1.2 試劑

蛋白A(美國IL公司);硫堇(英國Alfa Aesar公司);氯金酸(美國Acros Organics公司);17β－雌二醇(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);辣根過氧化物酶標記的17β－雌二醇(天津天健生物制藥公司);磷酸鹽緩沖片(PBS，pH7.4)、兔抗17β－雌二醇抗體、牛血清白蛋白(BSA)均來自美國Sigma公司;甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純;實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫電極的制備

實驗中的電極如圖1，工作電極:直徑2.5 mm，銀底碳電極;對電極:銀底碳電極;參比電極:銀－氯化銀電極。取同一批次的電極用無水乙醇和去離子水各超聲清洗5 min，然后在0.1 g/L氯金酸溶液中用恒電位法(－0.2 V)沉積60 s，沉積前先向氯金酸溶液中通入高純氮氣20 min以除氧，沉積后用去離子水清洗表面，用高純氮氣吹干。

圖1 絲網(wǎng)印刷電極的組成

取5 μL濃度為1 g/L蛋白A溶液滴加到工作電極表面，4℃冰箱中過夜，然后反復清洗表面，室溫干燥。取5 μL濃度為0.1 g/L兔抗17β－雌二醇抗體溶液滴加到工作電極上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1 h，PBS清洗后用1%的BSA在4℃冰箱中封閉2 h，反復清洗，最后在工作電極表面滴一滴pH7.4的PBS，放入4℃冰箱備用(每一步反應結束后都用pH 7.4的PBS反復清洗以除掉未結合的試劑)。

1.3.2 標準系列的測定

用10%的甲醇將17β－雌二醇配成一系列標準溶液，分別取4 μL標準液和4 μL酶標17β－雌二醇(稀釋倍數(shù)為1∶100)滴加到免疫電極的工作電極上，用微量加樣器在電極表面輕輕混合3次，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min，用PBS反復清洗后在1 mmol/L 的硫堇［13］+0.03%H2O2溶液(pH5.5乙酸鹽緩沖液配制)中用循環(huán)伏安法測定還原峰電流值，峰電流與雌二醇含量呈負相關。

1.3.3 尿中17β－雌二醇的測定

分別收集正常男性和女性尿樣各10例測定。尿中的17β－雌二醇主要以結合態(tài)的形式存在，為了不影響免疫反應，首先要對其進行解離。采用酸水解法［14］，取0.5 mL尿樣于4 mL具塞離心管中，加入0.05 mL濃鹽酸和0.5 mL甲醇，80℃水浴1 h，然后用5 mol/L的NaOH 溶液調(diào) pH 至7.0 ～7.5，用 pH 7.4 的 PBS 稀釋到4 mL，此時尿樣稀釋8倍，10 000 rot/min高速離心10 min后，取上清液檢測，測定步驟按照2.3。

2 結果與討論

2.1 修飾納米金條件的優(yōu)化及表征

電極在0.1 g/L氯金酸溶液中，經(jīng)不同時間沉積后，測定硫堇－過氧化氫體系的還原峰電流值。隨著沉積時間的增加硫堇－過氧化氫體系的還原電流逐漸增大，當沉積時間增加到60 s以后峰電流變化不大，結果見圖2。對沉積時間為60 s的電極進行掃描電鏡表征，結果如圖3所示，金顆粒的平均粒徑小于30 nm，一致性較好。因此選擇在0.1 g/L氯金酸溶液中－0.2 V電壓下沉積60 s作為沉積條件。

圖2 納米金沉積時間對響應信號的影響測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

圖3 沉積時間為60 s的掃描電鏡圖

2.2 修飾電極的循環(huán)伏安法表征

用循環(huán)伏安法表征不同修飾階段的電極，如圖4所示。與裸電極相比，修飾納米金后電極在硫堇－過氧化氫溶液中的響應電流增大，這是因為修飾了納米金后電極比表面積增大，有利于電活性物質(zhì)的電化學反應、另外修飾納米金后也加快了電極的電子傳遞。當納米金上吸附蛋白A后響應電流下降，因為蛋白A大分子阻礙了電子傳遞。當?shù)鞍譇上固定抗體后電流再次下降，因為抗體為大分子蛋白質(zhì)進一步阻礙電子傳遞?？贵w與酶標抗原結合后電流有較大幅度的增長，是酶催化作用的結果。

圖4 修飾電極的循環(huán)伏安法表征圖測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.3 蛋白A的作用

比較了未修飾和修飾蛋白A電極的測定信號，如圖5所示。修飾了蛋白A的電極，經(jīng)固定抗體和免疫反應后，測定硫堇－過氧化氫體系的還原電流信號明顯增強，而相比之下，未修飾蛋白A的免疫電極測定信號小很多。由此得知蛋白A在電極的修飾過程中起到重要的作用，可增加抗體固定量并介導抗體有序定向修飾，提高抗體利用率;并且避免了抗體直接固定到納米金上易失活、在洗脫過程中易脫落的問題，進而提高免疫反應的靈敏度，所以對電流響應有明顯增強作用。該免疫傳感器與17β－雌二醇在玻碳電極上的直接差分脈沖伏安法測定比較，靈敏度提高約4個數(shù)量級［15］。

圖5 蛋白A對測定信號的影響測試底液為1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.4 溫育時間對測定的影響

考察了溫育時間對抗原抗體反應的的影響，結果如圖6所示。隨溫育時間的增加，響應信號增大，表示免疫反應需要足夠的時間才能完成。當溫育時間超過30 min后還原峰電流不再增加，說明免疫反應已趨于穩(wěn)定，所以選擇30 min作為溫育時間。

圖6 溫育時間對最后測定信號的影響

2.5 標準曲線

在優(yōu)化條件下，用修飾好抗體的免疫電極對17β－雌二醇標準系列進行測定，標準液中17β－雌二醇含量與酶催化的硫堇－過氧化氫體系還原峰電流呈負相關，見圖7。17β－雌二醇含量在0.1 μg/L ～20 μg/L范圍內(nèi)與被測信號有良好線性關系，R2=0.9899，線性回歸方程為 y=3.8508－0.4843lgc(P＜0.05)，檢出限為0.035 μg/L，圖8 顯示不同濃度 17β－雌二醇的實際測定曲線。

圖7 測定17β－雌二醇的標準曲線

圖8 循環(huán)伏安法測定不同濃度17β－雌二醇從下到上17β－雌二醇濃度依次為0、0.1 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L

2.6 方法精密度

選用濃度為1 μg/L和10 μg/L兩個標準溶液分別平行測定8次，結果見表1，響應信號的RSD%均小于1%，該方法一致性較好。

表1 方法精密度

2.7 樣品分析

取正常男性和女性(年齡在23歲～28歲)尿樣各10份，測定雌二醇含量，結果見表2。男性尿樣中17β－雌二醇含量在0～7 μg/L之間，女性由于受排卵周期的影響尿樣中17β－雌二醇含量范圍較寬，在10 μg/L～100 μg/L之間，結果與用色譜法測定的相關報道一致［16］。選擇男女各1份尿樣對精密度進行考察，結果如表3，RSD%＜10%，一致性較好。選擇男女各3份尿樣考察回收率，結果如表4，回收率在96%～114%范圍內(nèi)。在免疫電極表面滴上一滴pH 7.4的PBS，放入4℃冰箱7 d，對同一樣本的測定信號僅下降1%，說明該傳感器穩(wěn)定性較好。

表2 人體尿樣中17β－雌二醇的測定

表3 人體尿樣中17β－雌二醇測定的精密度分析

表4 人體尿樣中17β－雌二醇含量的加標回收率測定

3 結論

本文研究了基于納米金和蛋白A修飾電極的免疫傳感器，對17β－雌二醇的測定顯示了非常高的靈敏度，測定實際樣品結果較好，有望應用于環(huán)境、食品、動物體液中該物質(zhì)的快速測定，對于其它激素類物質(zhì)的測定也有一定借鑒價值。

［1］ 吳明紅，任來堂，徐剛，等.甾體雌激素的污染水平及轉化機制［J］.自然雜志，2010，32(2):76－79.

［2］ Mathur P P，D’Cruz S C.The Effect of Environmental Contaminants on Testicular Function［J］.Asian J Androl，2011，13(4):585－591.

［3］ Ociepa-Zawal M，Rubis B，Wawrzynczak D，et al.Accumulation of Environmental Estrogens in Adipose Tissue of Breast Cancer Patients［J］.J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng，2010，45(3):305－312.

［4］ Hanselman T A，Graetz D A，Wilkie A C.Manure-Borne Estrogens as Potential Environmental Contaminants:A Review［J］.Environ Sci Technol，2003，37(24):5471－5478.

［5］Caˇglayan M G，Palabiyik I M，Onur F.Development and Validation of Spectrophotometric and High-Performance Column Liquid Chro-matographic Methods for the Simultaneous Determination of Dienogest and Estradiol Valerate in Pharmaceutical Preparations［J］.J AOAC Int，2010，93(3):862－868.

［6］Matějíˇcek D.On-Line Two-Dimensional Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric Determination of Estrogens in Sediments［J］.J Chromatogr A，2011，1218(16):2292－2300.

［7］ Zhang Z，Rhind S M，Kerr C，et al.Selective Pressurized Liquid Extraction of Estrogenic Compounds in Soil and Analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2011，685(1):29－35.

［8］ 魏慧斌，林金明，吳丹凝，等.水體及人體液中的雌二醇的高靈敏度化學發(fā)光酶免疫分析［J］.分析化學，2007，35(3):320－324.

［9］ Caron E，Sheedy C，F(xiàn)arenhorst A.Development of Competitive ELISAs for 17 Beta-Estradiol and 17 Beta-Estradiol+Estrone+Estriol Using Rabbit Polyclonal Antibodies［J］.J Environ Sci Health B，2010，45(2):145－151.

［10］湯琳，曾光明，黃國和，等.免疫傳感器用于環(huán)境中痕量有害物質(zhì)檢測的研究進展［J］.環(huán)境科學，2004，25(4):170－176.

［11］周谷珍，李繼山，蔣健輝，等.基于酶催化沉積放大的電化學阻抗法用于人免疫球蛋白 M的檢測［J］.分析化學，2006，34(2):155－158.

［12］陳珠麗，郭希山，朱松明.基于納米金修飾絲網(wǎng)印刷電極的乙醇生物傳感器［J］.傳感技術學報，2009，22(12):1686－1689.

［13］趙廣英，邢豐峰.基于瓊脂糖和納米金的電流型免疫傳感器快速檢測副溶血性弧菌［J］.傳感技術學報，2007，20(8):1697－1700.

［14］毛麗莎，孫成均，李永新，等.柱前熒光衍生－高效液相色譜法測定尿和血清中的環(huán)境雌激素［J］.分析化學，2005，33(1):33－36.

［15］ Salci B，Biryol I.Voltammetric Investigation of Beta-Estradiol［J］.J Pharm Biomed Anal，2002，28(3－4):753－759.

［16］吳鴛鴦，施衛(wèi)星，陳樞青.GC/MS同時檢測人體尿液中β－雌二醇、雙酚A、己烯雌酚和沙丁胺醇的含量［J］.浙江大學學報(醫(yī)學版)，2009，38(3):235－241.