戴啟剛，黃仕文，汪受傳

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046）

地龍，性寒味咸，具有清熱息風(fēng)、通絡(luò)、平喘、利尿之功效。現(xiàn)代研究表明其具有溶栓、纖溶、抗癌、抗心律失常、解熱、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)傷口愈合、殺精作用。其對(duì)平滑肌的作用，視平滑肌所處器官而定，如能舒張支氣管平滑肌從而平喘［1］，對(duì)子宮平滑肌則有興奮作用［2］，對(duì)人體最大的器官－胃腸道平滑肌的作用及作用機(jī)制報(bào)道很少，且作用效果報(bào)道不一［3-4］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌的作用，并加入胃腸平滑肌常見(jiàn)表面受體阻斷劑觀察作用變化，藉以闡明其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠（200±20）g，雌雄不限，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（滬）2007-0005。

1.1.2 藥品與儀器 烏頭赤石脂丸（蜀椒、制川烏、附子、干姜、赤石脂；鮮地龍（赤子愛(ài)勝蚓，Eisenia foetida），南京農(nóng)業(yè)研究所；阿托品，鄭州羚銳制藥有限公司；酚妥拉明，上海第十三制藥廠；普萘洛爾，Sigma公司。HW－400S恒溫平滑肌槽、BL－420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；張力傳感器（JZ－2型），中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所；XHF-1內(nèi)切式勻漿機(jī)，浙江寧波新芝科學(xué)儀器研究所；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；自制鉑金絲雙電極。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克氏液（Krebs）配制 將NaCl 6.92 g、KCl 0.35 g、CaCl20.35 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、葡萄糖2.0 g溶于雙蒸水并定容至1000 mL即得。

1.2.2 地龍勻漿液（DLYJY）的制備 取地龍鮮品，與克氏液按質(zhì)量 1∶1、1∶2、1∶4、1∶9 的比例混和，在冰浴中以 2000 rpm的速率進(jìn)行內(nèi)切勻漿，勻漿混和液在4℃下以13000 rpm的速率離心，取上清，所得即為所需的50%、33.3%、20%、10%（w：w）的地龍勻漿液，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 胃底平滑肌條制備 參照文獻(xiàn)［5］制備胃底平滑肌條：將禁食24 h的SD大鼠脫頸椎處死，迅速打開(kāi)腹腔，取胃，在預(yù)冷的克氏液中清洗干凈胃內(nèi)容物，取胃底，沿胃小彎剪開(kāi)胃腔，鋪開(kāi)，用剪刀沿環(huán)行肌方向?qū)⑽傅捉徊婕糸_(kāi)2～3道切口，使之形成較長(zhǎng)的胃條，剪取4 cm的肌條一段。將胃底肌條一端固定在恒溫水浴槽獨(dú)立內(nèi)管底部的玻璃彎鉤上，另一端固定在張力傳感器上。恒溫水浴槽內(nèi)溫度為37℃，使獨(dú)立內(nèi)管的溫度保持在37℃，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體。肌條在1 g的前負(fù)荷下溫浴，每20 min更換一次新鮮的37℃克氏液，溫浴1 h，待肌條的自發(fā)活動(dòng)平穩(wěn)后再加入藥液進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 地龍勻漿液對(duì)大鼠胃底平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響及最佳濃度的選擇 向在恒溫水浴槽獨(dú)立內(nèi)管中固定并平衡好的胃底平滑肌條加入不同濃度的地龍勻漿液后，描記收縮曲線，觀察其對(duì)胃底平滑肌的作用，選擇最佳作用濃度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)。

基本流程為：待胃底平滑肌穩(wěn)定后，記錄5 min其正常的收縮曲線后滴加不同濃度的37℃地龍勻漿液，記錄給藥后5 min的收縮曲線，操作順序?yàn)椋好栌浾Ｊ湛s曲線→換液→10%地龍勻漿液10 mL→克氏液洗滌3遍后換液→20%地龍勻漿液10 mL→克氏液洗滌3遍后換液→33.3%地龍勻漿液10 mL→克氏液洗滌3遍后換液→50%地龍勻漿液10 mL（以上每次滴加重復(fù)3次），重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)均需先平衡，每次用藥間隔15 min。如平滑肌的自發(fā)收縮曲線已不穩(wěn)定，可換平滑肌條再進(jìn)行重復(fù)操作。

1.2.5 地龍勻漿液及受體阻斷劑對(duì)胃底平滑肌的作用研究 按上述過(guò)程描記正常收縮曲線后，加入最佳濃度的地龍勻漿液描記收縮曲線后，分別加入M受體阻斷劑阿托品（終濃度50 μg/mL）、α受體阻斷劑酚妥拉明（終濃度50 μg/mL）、β 受體阻斷劑普萘洛爾（終濃度 50 μg/mL）并描記收縮曲線，觀察加藥前后收縮力的變化，比較張力變化率，闡明地龍作用后可能的作用機(jī)制。

張力變化率的計(jì)算：以給予阻斷劑前5 min離體胃底平滑肌的平均張力（即地龍作用后的平均張力）作為對(duì)照值，給予阻斷劑后5 min內(nèi)的平均張力作為效應(yīng)值，計(jì)算給予阻斷劑后離體胃底平滑肌平均張力的變化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響及最佳濃度的選擇

結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同濃度地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力及頻率的影響 （±s）

表1 不同濃度地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力及頻率的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組相比，1）P＜0.01

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由表1、圖1可知，與正常對(duì)照組比較，33.3%、50%地龍勻漿液組可明顯降低大鼠離體胃底平滑肌收縮頻率和收縮張力（P＜0.01），但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另考慮到一條平滑肌要重復(fù)檢測(cè)其收縮性，如對(duì)其抑制作用太強(qiáng)，則其恢復(fù)至平衡狀態(tài)所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于下一步的操作，故我們選擇33.3%地龍勻漿液作為最佳給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 地龍勻漿液聯(lián)合受體阻斷劑對(duì)胃底平滑肌作用的研究

33.3%地龍勻漿液分別聯(lián)合阿托品、酚妥拉明、普萘洛爾先后作用于胃底平滑肌，可見(jiàn)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力變化如表2、圖2、圖3、圖4所示。

表2 阻斷劑使用前后胃底平滑肌收縮張力變化率比較 （±s）

表2 阻斷劑使用前后胃底平滑肌收縮張力變化率比較 （±s）

注：與 DLYJY+阿托品比較，1）P＜0.01

?

圖2 阿托品及地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力的影響

圖3 酚妥拉明及地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力的影響

圖4 普萘洛爾及地龍勻漿液對(duì)大鼠離體胃底平滑肌收縮張力的影響

由圖2～圖4及表2所示可知，使用受體阻斷劑后3組胃底平滑肌張力變化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

胃腸平滑肌的運(yùn)動(dòng)受交感神經(jīng)、副交感迷走神經(jīng)及內(nèi)在腸神經(jīng)所支配。副交感迷走神經(jīng)主要釋放乙酰膽堿與平滑肌平面M受體結(jié)合后可使胃底平滑肌細(xì)胞收縮，使收縮張力加大，收縮頻率加快。交感神經(jīng)可釋放去甲腎上腺素，與α受體結(jié)合后可使平滑肌收縮，張力加大，頻率加快。與β受體特別是β2受體結(jié)合后可使平滑肌松馳，張力減少，頻率下降。

本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)33.3%地龍勻漿液作用于胃腸離體平滑肌后，可見(jiàn)胃底平滑肌松弛。再加入阿托品后，胃底平滑肌繼續(xù)松弛，兩者的作用存在著協(xié)同，無(wú)拮抗，表明地龍勻漿液中可能含有類(lèi)似M受體阻斷劑成分。它可阻斷M受體與激動(dòng)劑的結(jié)合，從而使平滑肌松弛。加入酚妥拉明和普萘洛爾，胃底平滑肌的狀態(tài)無(wú)明顯變化，似表示胃底平滑肌表面無(wú)相應(yīng)的α受體和β受體，亦或表明地龍勻漿液中還存在類(lèi)似α和β受體激動(dòng)劑成分，其作用抵消了α受體阻斷劑酚妥拉明或β受體阻斷劑普萘洛爾的作用。究竟地龍勻漿液發(fā)揮舒張胃底平滑肌的作用是否與α、β受體有關(guān)，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

離體實(shí)驗(yàn)表明，地龍勻漿液能舒張胃底平滑肌，其最佳濃度為33.3%，其作用機(jī)制可能是阻斷了M受體。

［1］劉以民，張德新，杜亞明.地龍湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘豚鼠平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2007，14（1）：21-22.

［2］鄭梅，楊榆青，陳嶸，等.地龍水煎液對(duì)未孕大鼠離體子宮平滑肌作用的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（3）：463-464.

［3］梅全喜，畢煥新.現(xiàn)代中藥藥理手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1998：310.

［4］張保國(guó)，張大祿.動(dòng)物藥［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003：312.

［5］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：429-435.