陳福順，王 卓，王湘慶，郎森陽

(解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853)

癲癇是由大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的腦部疾病，具有突然發(fā)生、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。目前的抗癲癇藥物大多通過降低神經(jīng)元興奮性或增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起作用。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，多年來癲癇的發(fā)生被認(rèn)為是中樞內(nèi)GABA抑制作用減弱或缺乏的結(jié)果。orexin又稱hypocretin，因其首先于1998年在下丘腦發(fā)現(xiàn)，并與食欲有關(guān)，故命名為食欲素，包括orexin-A和orexin-B(又稱為食欲素A型和食欲素B型)，均為orexin前體的分解產(chǎn)物[1-2]，其受體共有2種亞型—orexin1R及orexin2R，廣泛分布于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1-5]，此后又發(fā)現(xiàn)其與交感神經(jīng)活動(dòng)[6]以及睡眠和覺醒狀態(tài)的調(diào)控有關(guān)[7-8]，而對(duì)于其與癲癇的有關(guān)研究，有實(shí)驗(yàn)[9]證實(shí)orexin能增強(qiáng)GABA電流，也有報(bào)道[10]認(rèn)為反復(fù)癲癇發(fā)作患者腰穿腦脊液中orexin-A濃度少于非癲癇患者，但有關(guān)orexin-B的研究尚未見報(bào)道。因此，orexin可能與癲癇的發(fā)生或控制有關(guān)。目前對(duì)于orexin-B在癲癇發(fā)作后多時(shí)間點(diǎn)變化的研究國內(nèi)外均未見報(bào)道，因此本研究采用海人酸(kainic acid，KA)腹腔注射誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，用免疫組化方法檢測(cè)orexin-B及其神經(jīng)纖維在不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況，以闡明orexin-B在癲癇發(fā)生中的變化，深化癲癇的發(fā)病機(jī)制，且為癲癇治療開拓一個(gè)新的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器和試劑成年雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供。冰凍切片機(jī)為Lei CA CM1900，Olympus BX53顯微鏡，KA(編號(hào)KA0250)購自Sigma公司，羊抗orexin-B多克隆抗體(編號(hào)SC-8071)為Santa Cruz公司產(chǎn)品，超敏即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒(編號(hào)PV-9003)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作本實(shí)驗(yàn)符合衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理指導(dǎo)意見和解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)，飼料與水充足供應(yīng)，自由攝取。動(dòng)物房室溫22℃，濕度20%～30%，12 h-12 h明暗交替。先飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，按動(dòng)物體重大小編號(hào)，隨機(jī)分為6組，每組5只：①經(jīng)腹腔注射KA誘發(fā)急性癲癇發(fā)作后的時(shí)間點(diǎn)，按第8小時(shí)、1、3、7天，分別分為8 h、1 d、3 d和7 d組；②慢性復(fù)發(fā)型組為腹腔注射KA誘發(fā)癲癇發(fā)作之后第7天再用KA(4 mg·kg-1)注射誘發(fā)癲癇發(fā)作；③正常對(duì)照組，腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 動(dòng)物行為學(xué)觀察及癲癇變化強(qiáng)度分級(jí)大鼠經(jīng)腹腔注射KA后，觀察其行為學(xué)變化，按Racine描述的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷并詳細(xì)記錄：1級(jí)，閉眼、豎毛，胡須抖動(dòng)，嗅、面部抽搐；2級(jí)，點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、咀嚼運(yùn)動(dòng)、沿著面部肌肉痙攣；3級(jí)，一側(cè)前肢抬起，輕微陣攣；4級(jí)，用后肢站起，伴有兩側(cè)前肢的陣攣；5級(jí)，站立、雙側(cè)前肢陣攣加重，失去平衡跌倒伴全身陣攣[11]。

1.4 動(dòng)物處死及標(biāo)本制備大鼠于致癇發(fā)作后的8 h、1 d、3 d、7 d、慢性復(fù)發(fā)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，以2%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)將大鼠麻醉后，經(jīng)左心室刺入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，先快速灌注冷PBS 200 mL后，再灌注4%多聚甲醛 0.1 mol、 PBS (pH 7.4,4℃) 250 mL，開顱取腦,固定于上述灌注液中,然后經(jīng)含15%、20%，30%蔗糖的PBS溶液先后梯度脫水沉底,待腦組織沉底后，取腦組織修塊，根據(jù)Paxinos大鼠圖譜定位神經(jīng)核團(tuán)[12]，自對(duì)耳線10.70 mm處開始至對(duì)耳線2.7 mm止的范圍內(nèi)于冰凍切片機(jī)上行厚度為30 μm的冠狀位連續(xù)切片。分別將切片置于24孔中，每孔為連續(xù)的10張，并用凍存液-20℃保護(hù)切片。

1.5 orexin-B細(xì)胞及其神經(jīng)纖維的免疫組織化學(xué)染色每只動(dòng)物選取4片切片，選取部位為對(duì)耳線5.7～6.7 mm范圍內(nèi)的連續(xù)4孔，每孔各取1片。用羊抗鼠多克隆抗體檢測(cè)orexin-B及其神經(jīng)纖維在大鼠腦片的表達(dá)。具體如下：①EDTA，95℃、15 min，PBST洗片，3 min×3次；②3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBST洗片，3 min×3次；③滴加10%兔血清，孵育1 h；④滴加一抗羊抗鼠多克隆抗體(1∶1 000，Santa Cruz)，4℃過夜；⑤棄去一抗，PBS洗片,3 min×3次；⑥滴加PV-9003試劑盒Polymer Helper，室溫孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑦滴加PV-9003試劑盒Poly-HRP anti-Goat IgG，室溫孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑧DAB顯色1 min，終止反應(yīng)；⑨裱片，自然晾干后，依次脫水透化，中性樹膠封片。鏡下觀察陽性表達(dá)部位呈棕黃色。

1.6 圖像處理利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)每張免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行定量分析。免疫組化染色切片經(jīng)Olympus BX53顯微鏡在10倍下觀察，并以其配備的DP72(Olympus)數(shù)碼照相機(jī)利用Olympus Cell Sens Ver1.2.1圖像攝取軟件攝取圖像，圖像像素為5 184×3 456。用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)定每張切片相應(yīng)部位的陽性細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)纖維的累積光密度(IOD)及其測(cè)量面積(area,μm2)，求出其平均光密度值(IOD/area)，測(cè)量面積截取每張切片相同部位丘腦室旁核處753 185 μm2。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察及處理經(jīng)腹腔注射KA(71±8) min后，大鼠表現(xiàn)為濕狗樣抖動(dòng)、前肢陣攣，甚至全身陣攣、失去平衡跌倒伴口吐白沫。癇性發(fā)作持續(xù)30 min后，腹腔注射地西泮(10 mg·kg-1)終止發(fā)作。

2.2 免疫陽性細(xì)胞分布情況各區(qū)組腦組織的多部位免疫組化切片實(shí)驗(yàn)表明：orexin-B免疫陽性細(xì)胞分布在大鼠下丘腦尤其是下丘腦外側(cè)區(qū)和穹窿周圍核，但是在海馬有可疑的陽性，且在8 h組orexin-B陽性最高，其次是3 d組。見圖1(插頁一)。

2.3 免疫陽性細(xì)胞數(shù)對(duì)照組和致癇后8 h、1 d、3 d和7 d組以及慢性復(fù)發(fā)型組orexin-B免疫陽性細(xì)胞的數(shù)目分別為73.89±46.31、66.26±40.82、67.61±42.58、92.31±46.24、32.75±30.25和77.82±57.28；7 d組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他相鄰組間免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各區(qū)組orexin-B免疫陽性細(xì)胞呈現(xiàn)先稍減少后恢復(fù)，之后減少再恢復(fù)的趨勢(shì)。各區(qū)組orexin-B免疫組化染片結(jié)果見圖2(插頁一)。

2.4 神經(jīng)纖維的分布免疫組化染色切片檢測(cè)結(jié)果表明：orexin-B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，在皮層、海馬、丘腦、下丘腦、室旁核等等各個(gè)部位都有分布。

2.5 orexin-B神經(jīng)纖維定量對(duì)各區(qū)組大鼠的丘腦室旁核進(jìn)行orexin-B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維的定量分析，對(duì)照組和致癇后8 h、1 d、3 d和7 d組以及慢性復(fù)發(fā)型組平均光密度值(IOD/area)結(jié)果分別為0.040 249 840±0.016 991 212、0.056 693 460±0.033 409 569、0.028 744 460±0.024 347 261、0.055 445 800±0.014 488 519、0.048 517 270±0.0144 987 200和0.039 411 090±0.010 738 182。隨著大鼠致癇后時(shí)間的變化，orexin-B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維平均光密度值變化呈現(xiàn)出先增加后減少，再增加后又減少的變化趨勢(shì)。1 d組與8 h和3 d組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他相鄰組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組免疫組化染色結(jié)果見圖3(插頁一)。

3 討 論

癲癇是由于興奮性增加而抑制性減弱導(dǎo)致的高同步化放電，但其具體的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，只是認(rèn)為其與中樞內(nèi)GABA抑制作用減弱或缺乏有關(guān)。Martin 等[9]證實(shí)：orexin能增強(qiáng)GABA電流，有實(shí)驗(yàn)證明了orexin-B是如何興奮GABA能神經(jīng)元的，因此本實(shí)驗(yàn)探討了orexin-B與癲癇的關(guān)系。orexin-B免疫陽性細(xì)胞的分布局限于下丘腦和穹窿周圍核，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：orexin-B免疫陽性細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)為先稍減少后恢復(fù)，之后減少再恢復(fù)的趨勢(shì)。揭示癲癇發(fā)作后第7天，orexin-B在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)量最少，其他相鄰組間差異并不顯著，而Morales等[13]所做實(shí)驗(yàn)中只檢測(cè)了誘發(fā)癲癇后第2天與第4天orexin-B細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比無顯著差異，與本實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)結(jié)果相符。orexin-B免疫陽性細(xì)胞在海馬有可疑的陽性，且在8 h組陽性最高，其次是3 d組，是否意味著在癲癇發(fā)作后海馬區(qū)有該神經(jīng)元細(xì)胞的增多有待進(jìn)一步探究。orexin-B神經(jīng)纖維分布廣泛，在皮層、海馬、丘腦、下丘腦、室旁核等各個(gè)部位都有分布，其免疫陽性神經(jīng)纖維平均光密度值呈現(xiàn)出與其細(xì)胞數(shù)相反的變化。Morales等[13]的實(shí)驗(yàn)表明：orexin-B神經(jīng)纖維在致癇后第2天比第4天減少，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

結(jié)合orexin-B免疫陽性細(xì)胞及其神經(jīng)纖維的檢測(cè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)有2個(gè)新發(fā)現(xiàn)：①orexin-B細(xì)胞數(shù)及其神經(jīng)纖維在大鼠癲癇發(fā)生后有變化；②兩者之間變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出相反的關(guān)系，推測(cè)其原因?yàn)榘d癇發(fā)作后，orexin-B物質(zhì)由神經(jīng)元內(nèi)經(jīng)其神經(jīng)纖維傳遞至其受體起作用，這表明其可能參與了癲癇神經(jīng)元放電和傳播的抑制調(diào)節(jié)作用，通過增加該物質(zhì)在大腦中的濃度可能有助于癲癇發(fā)作的控制。

[致謝：感謝協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所藥理教研室左萍萍教授及課題組楊楠老師等的幫助與指導(dǎo)。]

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