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        骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能異常在雌激素所致骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用研究

        2012-04-15 09:53:30楊小紅
        創(chuàng)傷外科雜志 2012年1期
        關(guān)鍵詞:成脂成骨分化

        廖 立,楊小紅,金 巖

        骨質(zhì)疏松是最常見的三大老年性疾病之一,嚴(yán)重危害老年人群的身體健康。其發(fā)病機制不一,包括遺傳性、廢用性、代謝異常、退行性、激素水平異常、藥物因素等[1],其中,絕經(jīng)后雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松在其中占據(jù)了很大一部分,>50歲女性因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折的風(fēng)險>20%[2]。相關(guān)的機制研究過去主要集中于破骨細(xì)胞的異常活化上,大量研究表明,雌激素缺乏可以通過核因子活化因子受體及其配體(RANKL/RANK)途徑刺激破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[3-4];還能夠直接導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子配體(FasL)表達(dá)下降,使破骨細(xì)胞凋亡下降,延長存活時間[5]。但是,近年來不少學(xué)者提出,骨改建是一個成骨與破骨動態(tài)平衡的過程,成骨及破骨的失衡才是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因[6]。干細(xì)胞作為各種組織細(xì)胞的來源,在維持組織的新陳代謝和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用,越來越多的研究提出,干細(xì)胞功能障礙與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān),特別是衰老等退行性變中作用明顯[7]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,其在骨骼發(fā)育與重建的過程中的作用逐漸受到重視。研究發(fā)現(xiàn)[8-9],BMMSC成骨和成脂分化的失調(diào)會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松或者骨量過高;二聚糖基因(Biglycan)敲除導(dǎo)致小鼠成骨祖細(xì)胞凋亡增加和增殖減弱,導(dǎo)致進行性的骨質(zhì)疏松[10];細(xì)胞凋亡蛋白酶3(caspase3)抑制劑能夠通過影響B(tài)MMSC的分化而加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程[11];活化的T細(xì)胞可以通過凋亡相關(guān)因子及其配體(Fas/FasL)通路導(dǎo)致BMMSC的凋亡而促進骨質(zhì)疏松[12];老年人群的BMMSC的增殖及分化功能均有減退,與骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)相一致[13]。這些實驗證明了BMMSC功能和數(shù)量的異常將導(dǎo)致骨骼發(fā)育和骨改建的異常。但是對于雌激素缺乏如何導(dǎo)致BMMSC的功能失調(diào)仍尚不明確。在本研究中,我們通過建立去勢小鼠骨質(zhì)疏松動物模型,提取BMMSC進行體外培養(yǎng)和功能檢測,明確其內(nèi)源性的增殖及分化功能改變,并采用檢測關(guān)鍵基因表達(dá)水平和microRNA表達(dá)譜分析,從分子水平探索其生物學(xué)行為變化的原因。

        材料與方法

        1 卵巢切除組(OVX)小鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

        取8周齡C57小鼠40只,隨機分為OVX組和假手術(shù)組(Sham)組,每組20只。OVX組以1%戊巴比妥鈉麻醉后,從背部開口尋找到雙側(cè)卵巢,于子宮頸部結(jié)扎后切除卵巢,縫合傷口。Sham組尋找到卵巢后僅切除部分脂肪組織,縫合傷口。置于無特定病原體(SPF)級動物房飼養(yǎng),自由進食水3個月后取雙側(cè)股骨進行組織學(xué)檢測。

        2 組織學(xué)檢測

        取小鼠雙側(cè)脛骨及股骨,多聚甲醛固定4h后置于10%乙二胺四乙酸(EDTA)內(nèi)脫鈣10d,隔天換液。流水沖洗過夜后石蠟包埋,常規(guī)切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察并照相。

        3 BMMSC體外培養(yǎng)

        小鼠BMMSC的體外培養(yǎng)參照以往的方法。小鼠頸椎脫臼后剝?nèi)」晒羌懊劰?,剔除表面肌肉及軟組織,以1ml針管沖洗骨髓后接種于含10%胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)的α-最小必須培養(yǎng)基(α-MEM)內(nèi),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每2天半量換液,當(dāng)密度達(dá)到80%后以2×104/cm2的密度傳代。

        4 生長曲線

        采用P3代的小鼠細(xì)胞以5×104每孔分別接種于12孔板中,接種后2、4、6、8、10、12、14、16d以胰酶消化后計數(shù)。

        5 成骨誘導(dǎo)及檢測

        成骨誘導(dǎo)液配方為α-MEM,加入10% FBS,100nmol/L地塞米松,5mmol/L甘油磷酸鈉和50μg/ml左旋維生素C(Sigma公司)。細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板內(nèi),待密度達(dá)到85%以后加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21d。以4%甲醛固定后,采用茜素紅染色檢測成骨分化,并以10%西吡氯銨洗脫后用分光光度計檢測570nm光吸收值,行定量分析。

        6 成脂誘導(dǎo)及檢測

        成脂誘導(dǎo)液配方為α-MEM,加入10% FBS,0.5nmol/L異丁基甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma),2μmol/L胰島素(Sigma)和10nmol/L地塞米松(Sigma)。細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板內(nèi),待密度達(dá)到95%以后加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14d。以4%甲醛固定后,采用油紅染色檢測成脂分化,并以異丙醇洗脫后用分光光度計檢測520nm光吸收值,行定量分析。

        7 microRNA芯片分析

        取術(shù)后3個月OVX組及sham組小鼠各9只,取股骨及脛骨骨髓常規(guī)培養(yǎng)BMMSC,待原代細(xì)胞密度達(dá)到80%后分別提取RNA,質(zhì)檢合格后以同組每3個RNA樣本等量混合,將得到的每組各3個混合RNA混合樣本行雙色microRNA微陣列芯片檢測(LC-μParafloTM微流體芯片,杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司)。3張芯片的信號數(shù)據(jù)進行歸一化處理后,進行統(tǒng)計學(xué)分析。

        結(jié) 果

        1 C57小鼠骨質(zhì)疏松模型的建立及鑒定

        C57小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后3個月,進行體重檢測,發(fā)現(xiàn)OVX組小鼠體重明顯重于Sham組。頸椎脫臼處死后,尸檢在OVX組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)卵巢,且子宮明顯萎縮;而Sham組具有正常的卵巢。取股骨遠(yuǎn)端進行組織學(xué)檢測(圖1),均顯示OVX組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨吸收明顯,骨小梁數(shù)量低于Sham組。同時發(fā)現(xiàn)干骺端生長板也較正常變薄,可能軟骨的形成和再生也受到了雌激素的影響。但是皮質(zhì)骨厚度和結(jié)構(gòu)沒有明顯變化,這與以往研究報道相一致,因為皮質(zhì)骨的改建需要較長的時間。以上結(jié)果表明本實驗成功建立了OVX小鼠骨質(zhì)疏松模型。

        2 OVX小鼠中BMMSC的增殖能力下降,多向分化能力改變

        將OVX組及Sham組小鼠BMMSC進行常規(guī)體外培養(yǎng),取P3代細(xì)胞進行細(xì)胞增殖和多向分化能力檢測。結(jié)果 顯示,OVX組BMMSC體外擴增能力較Sham組有一定下降(圖2)。對BMMSC進行分化能力檢測,成骨誘導(dǎo)染色后鏡下可以觀察到OVX組形成的鈣化結(jié)節(jié)較Sham組少,染色淺(圖3、4);但成脂誘導(dǎo)時OVX組有更多的脂滴形成(圖5、6);定量檢測也證明了這些區(qū)別(P<0.05)。證明OVX組BMMSC成骨分化能力要低于Sham組,而成脂分化能力則較強,與觀察到的組織學(xué)表現(xiàn)相一致。提示BMMSC的功能異常確實在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中發(fā)生了重要的作用。

        3 OVX小鼠BMMSC的功能障礙受到多種方式調(diào)控

        通過對OVX組和Sham組BMMSC中mRNA表達(dá)水平進行RT-PCR檢測(圖7),發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞成骨成脂分化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因如骨鈣素(OCN)、脂蛋白酯酶(LPL)和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)發(fā)生了明顯的改變,其變化趨勢與細(xì)胞成骨成脂分化功能改變相一致,但Runt蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-γ)這兩個在成骨成脂分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用的關(guān)鍵基因在mRNA水平并沒有發(fā)生明顯改變,提示可能在轉(zhuǎn)錄后水平受到了調(diào)控。

        通過對兩組BMMSC細(xì)胞RNA樣本進行microRNA微陣列芯片檢測,發(fā)現(xiàn)OVX組BMMSC的microRNA表達(dá)譜與Sham組相比發(fā)生了較明顯的改變。在BMMSC表達(dá)的339種已知microRNA中,有71種出現(xiàn)差異性表達(dá),占所有表達(dá)microRNA的20.94%。其中,在OVX組中上調(diào)的microRNA為29種,而下調(diào)的microRNA為42種。倍數(shù)差異在4倍以上的microRNA有24種,占總microRNA的7.08%(表1)。以上數(shù)據(jù)表明,microRNA表達(dá)水平在OVX小鼠BMMSC中發(fā)生了較明顯的變化,可能在骨質(zhì)疏松BMMSC中功能改變中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

        圖1 Sham及OVX組股骨遠(yuǎn)端切片(箭頭標(biāo)示為骨小梁結(jié)構(gòu))(HE×10倍)

        圖2 兩種BMMSC生長曲線比較

        圖3 兩種BMMSC成骨分化后形成的鈣化結(jié)節(jié)(茜素紅×100倍)

        圖4 兩種BMMSC成骨分化定量分析

        圖5 兩種BMMSC成脂分化后形成的脂滴(油紅 ×200倍)

        圖6 兩種BMMSC成脂分化定量分析

        圖7 兩種BMMSC基因表達(dá)RT-PCR結(jié)果

        表1 芯片中差異性表達(dá)microRNA統(tǒng)計

        討 論

        實驗結(jié)果表明,在雌激素缺乏條件下,BMMSC在增殖及分化能力上都出現(xiàn)了一定的異常,并且此異常與骨質(zhì)疏松中成骨能力下降的表型相一致,從而可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展過程中起到了一定的促進作用。有研究報道[1],在骨質(zhì)疏松發(fā)生早期,破骨細(xì)胞的過度活化發(fā)揮了主要作用,但隨著病情的發(fā)展,成骨功能的下降是導(dǎo)致后期骨質(zhì)疏松加重的主要因素。我們的研究采用的是去勢后3個月的小鼠,從骨質(zhì)吸收情況看,已經(jīng)到達(dá)了中后期,此期BMMSC功能異常所導(dǎo)致的成骨功能缺陷可能發(fā)揮了更為重要的作用。在后續(xù)實驗中可以觀察去勢小鼠短期和長期BMMSC的生物學(xué)行為改變,并與中后期BMMSC相比較,從而觀察BMMSC在骨質(zhì)疏松發(fā)病全程中的動態(tài)功能改變。

        同時,我們觀察到,雖然造成去勢后骨質(zhì)疏松的啟動因素是由于雌激素水平的下降,但是當(dāng)OVX組BMMSC進行正常體外培養(yǎng)(含雌激素培養(yǎng)基)時,BMMSC功能缺陷在體外培養(yǎng)期間(30d左右)并沒有恢復(fù),其增殖及分化能力中仍存在異常。一方面,因為BMMSC自身表達(dá)雌激素受體,受到雌激素的直接調(diào)控,可能是因為長期的激素缺乏可能對細(xì)胞造成一種“記憶效應(yīng)”[14],造成細(xì)胞難以短期逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)行為改變,但是當(dāng)雌激素水平恢復(fù)后能否完全逆轉(zhuǎn)或者多長時間能夠逆轉(zhuǎn)其功能改變將是一個有意義的課題,將為以后臨床作用于BMMSC治療的療效提供參考依據(jù)。另一方面,因為雌激素的靶點廣泛分布于全身各種組織和細(xì)胞中,雌激素水平的下降將引發(fā)全身一系列的改變,所以BMMSC也可能受到活化輔助性T細(xì)胞(Th)、繼發(fā)性激素改變、代謝改變等多種因素的共同作用,最終導(dǎo)致功能異常,所以單純體外恢復(fù)雌激素水平不能完全恢復(fù)其功能改變[15]。

        因為干細(xì)胞的功能很大程度上由重要功能基因的轉(zhuǎn)錄來決定,所以我們對成骨分化相關(guān)的ALP、OCN、RUNX2以及成脂分化相關(guān)的LPL、PPAR-r等重要基因進行了RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)ALP、OCN、LPL的表達(dá)改變與BMMSC的功能改變相一致,但是RUNX2以及PPAR-r的變化不明顯。由于近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了microRNA在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮了很重要的作用,所以骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的BMMSC功能缺陷不僅由基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)所引起,也可能由microRNA表達(dá)譜及表達(dá)水平的改變所決定。microRNA微陣列芯片的結(jié)果也支持我們的推斷,約1/5的microRNA表達(dá)發(fā)生了改變。但是,因為microRNA具有1個microRNA調(diào)控多個靶基因或者1個靶基因受多個microRNA調(diào)控的特點,所以具體是哪些microRNA參與了重要分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,以及具體如何調(diào)控,還需要進一步的實驗驗證。

        結(jié)論:本實驗證明了在雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松中,BMMSC的增殖能力減弱,成骨能力減弱,而成脂能力增強,這些功能障礙可能在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。而BMMSC的功能障礙可能是由基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控異常所共同引起。

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