王冠 (山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 濟(jì)南 250022) 代小芳 謝之景 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安）

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豬細(xì)小病毒的研究進(jìn)展

王冠 (山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 濟(jì)南 250022) 代小芳 謝之景 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安）

豬細(xì)小病毒病是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)感染引起的，可以導(dǎo)致初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔等。同時(shí)還可以引起仔豬非化膿性心肌炎(Bolt，1997)、皮炎癥狀(Kelly，1994)及消瘦性綜合征(Krakowka，2000)。該病廣泛存在于世界各大豬場(chǎng)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。

1 豬細(xì)小病毒病原學(xué)研究

1.1 PPV的形態(tài)和理化學(xué)特點(diǎn) PPV屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，二十面體等軸立體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，直徑約20~26nm。衣殼由32個(gè)殼粒組成，核心含單股負(fù)鏈DNA。

PPV具有耐酸性和耐酶性，在pH3~9的條件下穩(wěn)定。胰酶短時(shí)間(如1h)的處理，對(duì)其感染性沒(méi)有影響，反而能提高其感染效價(jià)，這可能是由于胰酶使病毒粒子在懸液中進(jìn)一步分散的結(jié)果。PPV耐熱，56℃處理48h或70℃ 2h后仍能部分保持感染力和血凝活性，但80℃經(jīng)5min加熱即可喪失活性。Mary等(1969)的研究表明：病毒在4℃極為穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，在-20℃和-70℃下經(jīng)1年以上的保存，其感染效價(jià)和血凝性都不改變。PPV對(duì)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及核糖核酸酶，以及對(duì)脂溶劑如乙醚、三氯甲苯、醇和脫氧膽酸鈉均有一定的抵抗力。

對(duì)各種消毒劑有很強(qiáng)的抵抗力，甲醛蒸汽和紫外線需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才能殺死PPV，0.5%漂白粉或氫氧化鈉5min可殺死PPV，2%戊二醛則需要20min左右，3%甲醛則需要2h。PPV具有血凝性，能凝集豚鼠、大鼠、小白鼠、恒河猴、貓、雞和人O型紅細(xì)胞，其中對(duì)豚鼠的紅細(xì)胞的凝集最好，不能凝集牛、倉(cāng)鼠和豬的紅細(xì)胞。雞紅細(xì)胞對(duì)PPV的敏感性有個(gè)體差異，不同的生理狀況、遺傳特性和年齡會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。此外，PPV的血凝活性還依賴(lài)于反應(yīng)的溫度，在4℃可以獲得最高的反應(yīng)滴度。

1.2 病毒分型 按照致病性與組織嗜性大致可分為4個(gè)類(lèi)型。第1類(lèi)以NADL-2株為代表，可以用作弱毒疫苗來(lái)防制PPV感染，但通過(guò)子宮接種有復(fù)制和感染的能力；第2類(lèi)是以NADL-8株為代表的強(qiáng)毒株，口服接種能夠穿過(guò)胎盤(pán)屏障，造成胎兒感染，形成病毒血癥；第3類(lèi)是以Kresse株為代表的皮炎型強(qiáng)毒株，可以致死免疫不充分的胎兒；第4類(lèi)以AF-83株為代表的腸炎型毒株，主要引起腸道的病變。雖然存在不同的PPV毒株，但是目前認(rèn)為PPV只有一個(gè)血清型。

1.3 PPV的生長(zhǎng)特性 PPV只能在來(lái)源于豬的細(xì)胞(如原代豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞和傳代系PK-15和人的某些傳代細(xì)胞(如Hela、KB、HEp-2、Lul32等細(xì)胞)中增殖，其中以原代豬腎細(xì)胞較為常用。但Vasudevacharya等(1992)報(bào)道，在犬系A(chǔ)-72細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，曾被PPV病毒污染過(guò)，且在此細(xì)胞上出現(xiàn)了明顯的變化，這可能是由于病毒在結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因處有幾個(gè)堿基發(fā)生變異，致使局部拓?fù)鋵W(xué)發(fā)生改變而引起的。因?yàn)镻PV的增殖需要細(xì)胞源DNA多聚酶，因此要獲得大量的病毒并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，一般在多數(shù)細(xì)胞都處于細(xì)胞繁殖周期的S期，即DNA合成期時(shí)進(jìn)行病毒的接種。

此外，培養(yǎng)的溫度對(duì)PPV的生長(zhǎng)也有一定的影響。Choi(1989)將NADL-8、NADL-2、KBSH和Kresse分別在32、37、39℃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果：NADL-8、NADL-2在3個(gè)溫度下沒(méi)有明顯的差別；Kresse株在32℃、37℃時(shí)生長(zhǎng)受到限制，在39℃時(shí)沒(méi)有影響。而KBSH株則正好相反，在39℃培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受限制，而在32℃、37℃時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響。體外復(fù)制溫度的差異可以解釋不同分離株在豬體內(nèi)復(fù)制能力和毒力的差異。

2 流行病學(xué)及流行狀況

2.1 流行病學(xué) 各種品系的豬及不同日齡的豬均可感染，豬以外的其他動(dòng)物不易感染。據(jù)報(bào)道，在牛、貓、綿羊、豚鼠、小鼠和大鼠中均能檢測(cè)到PPV的特異性抗體，兔感染后可致其流產(chǎn)、死產(chǎn)，這表明PPV的宿主范圍在擴(kuò)大，感染譜逐漸加寬。感染的公母豬是主要的傳染源，病毒可經(jīng)胎盤(pán)傳播給胎兒，形成垂直傳播；通過(guò)消化道和呼吸道感染也是豬群感染PPV的主要方式。Lucas等(1974)在被感染的公豬的睪丸內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PPV，并證明能通過(guò)交配傳染給母豬。

該病一般呈地方流行性或散發(fā)，在初次感染的豬場(chǎng)往往呈暴發(fā)性流行。由于PPV感染性強(qiáng)，且對(duì)外界環(huán)境及許多消毒劑都有一定的抵抗力，一旦侵入健康的豬群，在三個(gè)月內(nèi)，幾乎導(dǎo)致100%的感染。Fujiska等(1975)報(bào)道：在該病發(fā)生后的豬場(chǎng)，能持續(xù)幾年甚至十幾年不斷出現(xiàn)生殖失敗。

2.2 流行狀況 PPV在世界各地的豬群中普遍存在，近年來(lái)，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展，PPV的感染呈現(xiàn)擴(kuò)大的趨勢(shì)，目前，想要尋找到PPV陰性的豬群已經(jīng)比較困難。

從60年代中期分離病毒并逐步確定其致病性以來(lái)，相繼已在比利時(shí)(1967)、德國(guó)(1968)、日本(1972)、美國(guó)(1972)、荷蘭(1972)、澳大利亞(1973)、南非(1975)、芬蘭(1979)、法國(guó)(1977)及加拿大(1978)、巴拿馬(1987)等國(guó)相繼報(bào)道(賴(lài)笑嫻，2010)。1982年由中國(guó)獸藥監(jiān)察所首次在國(guó)內(nèi)分離到該病毒。此后在上海(潘雪珠等，1983)、吉林(侯世寬等，1983)、四川(鄔捷等，1985)等地都分離到PPV。

3 PPV的診斷與防制

3.1 診斷 可根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)做出初步的診斷。一般認(rèn)為，如果僅妊娠豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒發(fā)育異常，同時(shí)有證據(jù)表明是傳染性疾病時(shí)，則應(yīng)考慮到PPV感染的可能。但進(jìn)一步確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷(朱潤(rùn)芝，2005)。病毒分離和鑒定是PPV感染最為確切的診斷方法。通常采取可疑的流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤(pán)等，其中以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟的分離率最高(殷震，1997)。但是此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且需要一定的技術(shù)條件和設(shè)備，從而限制其在臨床上的應(yīng)用。血清學(xué)檢測(cè)方法主要有血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)，該法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低，只能作為輔助診斷的方法；血清中和試驗(yàn)(SN)的特異性高于HI，但其操作時(shí)間長(zhǎng)，用于臨床的時(shí)效性太差；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HI一致且可用于毒大量的血清進(jìn)行檢測(cè)，具有省時(shí)、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)；乳膠凝集試驗(yàn)適用于臨床上的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，有良好的應(yīng)用前景；免疫熒光抗體技術(shù)(FAT)是一種精確性的技術(shù)，但存在非特異性染色的問(wèn)題；對(duì)流免疫電泳具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，有一定的推廣價(jià)值；此外還有銀加膠體金技術(shù)(SECGA)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電鏡試驗(yàn)等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)建立了許多更加敏感的診斷方法。核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等都具有快速、特異性強(qiáng)及靈敏度高等特點(diǎn)。綜上所述，豬細(xì)小病毒病的診斷方法很多。相對(duì)而言，目前臨床上應(yīng)用較多的是血清學(xué)診斷技術(shù)，特別是HA和HI試驗(yàn)，這兩種方法基本能滿(mǎn)足常規(guī)的病原檢測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查等需要。但要確診還需利用病毒分離鑒定方法。而分子生物學(xué)診斷方法靈敏度高、特異性好，檢測(cè)快速，結(jié)果可靠，隨著條件的完善，將會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

3.2 防制 同其他的許多病毒病一樣，該病目前還沒(méi)有有效的治療方法，主要以預(yù)防為主。由于PPV的血清型單一及其具有高免疫原性，使得疫苗接種成為控制PPV感染的一種行之有效的方法，于繁殖前給母豬接種疫苗是世界上大部分地區(qū)共用的方法。（1）疫苗：常用的弱毒疫苗主要有NADL-2弱毒株(Mengeling，1986)、HT變異株(Fujisakl，1982)、HT-SK-C株(Akihiro，1986)、N株(蔣玉雯等，1992)等。在國(guó)外多用NADL-2株，在國(guó)內(nèi)主要用N株。此外，葉向陽(yáng)等(1996)將PPV通過(guò)ST細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得弱毒株，經(jīng)安全性試驗(yàn)證實(shí)該毒株有良好的安全性及制成的疫苗有良好的免疫性。雖然已有多株弱毒疫苗在臨床上得到了應(yīng)用，但存在病毒重組及弱毒返強(qiáng)的危險(xiǎn)，使得弱毒苗的應(yīng)用受到一定的限制。而滅活疫苗一直被認(rèn)為是研制周期最短、最為安全可靠的疫苗。自1976年國(guó)外就有關(guān)于PPV滅活疫苗的研究報(bào)道，20世紀(jì)80年代在美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞等國(guó)家已普遍應(yīng)用。在我國(guó)，潘雪珠(1983)等學(xué)者也成功研制出PPV滅活疫苗。PPV疫苗研制中常用的滅活劑有福爾馬林、?丙內(nèi)酯(?-PL)、N-乙酰乙烯亞胺(AEI)及二乙烯亞胺(BEI)等；常用的佐劑有氫氧化鋁和油水乳劑。由于聯(lián)苗可以簡(jiǎn)化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)，現(xiàn)有的滅活聯(lián)苗有PPV-PRV(Mengeling，1980；鄔捷等，1988；)、PPV-JEV(姜天童等，1996)等，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明兩種病毒抗原同時(shí)刺激機(jī)體時(shí)未發(fā)生干擾作用。盡管PPV的弱毒苗和滅活苗在豬細(xì)小病毒病的預(yù)防控制中起到了十分重要的作用，但均存在不同程度的缺陷。如弱毒疫苗有發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)的潛在威脅；而滅活疫苗有產(chǎn)生抗體的時(shí)間較長(zhǎng)，免疫效果不穩(wěn)定等。因此，尋找更為安全有效的疫苗一直是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展給新型的PPV疫苗的研制和開(kāi)發(fā)提供了良好的契機(jī)，主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程多價(jià)亞單位疫苗、基因疫苗、以病毒為載體的重組活疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可飼(食)疫苗等。（2）目前我國(guó)已經(jīng)取得新獸藥證書(shū)的PPV疫苗有：上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所研制的PPV油乳劑滅活疫苗(三大類(lèi)新獸藥，(94)新獸藥證字第04號(hào))，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司聯(lián)合研制的PPV滅活疫苗(WH-1株)(三大類(lèi)新獸藥，(2006)新獸藥證字第71號(hào))，.農(nóng)業(yè)部2005年4月統(tǒng)一核發(fā)文號(hào)之前，各地取得PPV疫苗的文號(hào)有6個(gè)(桂生藥字(2003)191138；皖生藥字(2001)111138；農(nóng)生藥字(2001)561138；黑生藥字(2002)071138；遼生藥字(2001)051138和晉生藥字(2002)031138)(占利賓，2009)。（3）PPV疫苗的免疫程序：PPV的免疫主要以體液免疫為主，Mary和Cartwright報(bào)道，人工接種后6~9d，豬血清中即有抗體出現(xiàn)，14~21d抗體滴度達(dá)到1:1024~4096，大于70d的胚胎感染PPV，也可產(chǎn)生同樣高效價(jià)的抗體。仔豬出生后，隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸下降，到6~8月齡已檢測(cè)不到抗體，此時(shí)的初產(chǎn)母豬最容易感染PPV(黃秋月，2003)。Paul(1986)等發(fā)現(xiàn)豬群在接種PPV滅活苗時(shí)，母源抗體水平低的豬與血清學(xué)陰性豬的免疫應(yīng)答一樣，而中等水平的母源抗體對(duì)疫苗免疫有輕微的干擾作用，高效價(jià)抗體對(duì)疫苗有明顯的干擾作用。呂建強(qiáng)等(2002)進(jìn)行了PPV母源抗體對(duì)滅活疫苗免疫效果影響的研究，結(jié)果證實(shí)不論母源抗體水平高低均不會(huì)明顯抑制疫苗的主動(dòng)免疫反應(yīng)，但是主動(dòng)免疫的抗體反應(yīng)規(guī)律與豬體內(nèi)的母源抗體的效價(jià)有關(guān)系。在母源抗體滴度大于1:149.5時(shí)，滅活疫苗接種后抗體水平先降后升，升幅為1~3倍；而母源抗體小于1:25.6時(shí)，主動(dòng)免疫抗體一直持續(xù)上升，母源抗體陰性豬的抗體增幅最大。免疫接種的最佳時(shí)間是在初產(chǎn)母豬懷孕前的幾周內(nèi)進(jìn)行，以便在懷孕的整個(gè)敏感期都產(chǎn)生免疫力。對(duì)于初產(chǎn)母豬的免疫接種的時(shí)機(jī)多為5~6月齡，此時(shí)母源抗體已基本消失，不會(huì)干擾主動(dòng)免疫的形成，如不急于配種，最好可延至7月齡免疫，因?yàn)橛猩倭康暮髠淠肛i的母源抗體消失的速度較慢，但母源抗體一般不會(huì)超過(guò)7月齡(趙以云，2009)。

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（2011–09–27）

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