李曹龍，秦 艷，歐秀玲，崔鄭龍，王愛英 *，祝建波

（新疆石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

蛋白酶是一種重要的工業(yè)用酶，其生產(chǎn)幾乎占酶制劑市場(chǎng)的65%以上[1]，廣泛運(yùn)用于食品、藥物、皮革制備、蛋白水解和紡織工業(yè)等[2-3]。常溫蛋白酶作為生物大分子的活性物質(zhì)，因其在保存和應(yīng)用的過程中常常出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，特別是在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高滲等極端的條件下易失活，在工業(yè)應(yīng)用上受到了較大的限制[4]。耐熱蛋白酶由于具有顯著的熱穩(wěn)定性及其對(duì)有機(jī)溶劑、去垢劑和變性劑有較強(qiáng)的抗性而在蛋白酶應(yīng)用的各個(gè)領(lǐng)域顯示出極大的潛力[5]。

有“火洲”之稱的新疆吐魯番，有其獨(dú)特的氣候特征，干燥炎熱，強(qiáng)輻射。在夏季，其地表溫度可達(dá)75℃～80℃[6]。生活在這種極端環(huán)境下的微生物類群，有其獨(dú)特的特征。因此，采集新疆吐魯番地區(qū)土壤，從中分離篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株，通過對(duì)其產(chǎn)酶條件的研究，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2012年8月采集新疆吐魯番地區(qū)0～15cm的表層土樣。

1.2 儀器與試劑

烏魯木齊祥生儀器有限公司HANNApH211型PH計(jì)，上海凌光Spectrumlab 752S紫外可見分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，Eppendorf冷凍離心機(jī)，BIOMETRAT personalPCR儀。

100μg/L標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，0.02mol/L pH值為7.5磷酸緩沖液，10g/L酪素溶液，0.4mol/L三氯乙酸溶液。試驗(yàn)所需藥品均購自上海生工。

1.3 培養(yǎng)基

①LB平板培養(yǎng)基。

②生長培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10g，葡萄10g，酵母粉3g，NaCl 0.5g，瓊脂20g，pH值為7.0，121℃滅菌20min。

③篩選培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO41g，KCl 5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，瓊脂20g，pH值為7.2，121℃滅菌20min。脫脂乳10g，115℃滅菌15min。

④液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5g，葡萄糖5g，Na2HPO40.1g，CaCl20.1g，吐溫-80 1mL，pH值為7.0，121℃滅菌20min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 新疆吐魯番地區(qū)土壤中微生物的分離純化

將富集過夜的土壤懸液依次稀釋10-1、10-3、10-5的懸浮液，并從中各吸取40μL稀釋液，涂布與篩選平板培養(yǎng)基內(nèi)，用涂布器涂勻，至37℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落斜面保存。

1.4.2 高產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩（透明圈法）[7]

將純化保存的菌種活化，取活化培養(yǎng)好的培養(yǎng)液5mL，振蕩混勻后用接種環(huán)以點(diǎn)植法接種于脫脂乳固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48h后，記錄菌落及透明圈直徑。

1.4.3 高產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將產(chǎn)透明圈較大的3株菌株，接種到100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液于10000r/min 4℃離心10min，制備粗酶液。測(cè)定其酶活，確定高產(chǎn)蛋白酶菌株。

1.4.4 蛋白酶活力的測(cè)定[8]

蛋白酶活力定義為，40℃，pH 7.0條件下每分鐘水解產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量為1個(gè)活力單位（U）。提取C9、C21、C22菌株的蛋白酶粗酶液，用紫外光譜法測(cè)定蛋白酶活力。

式中：E表示蛋白酶活力，A表示由測(cè)得的吸光度，K表示吸光常數(shù)，V表示反應(yīng)試劑總體積，n表示酶液稀釋倍數(shù)，t表示反映時(shí)間，m表示酶體積。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察與生理生化試驗(yàn)[9]

革蘭氏染色法和顯微鏡鏡檢。生理生化試驗(yàn)包括V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)。

1.5.2 菌株的基因鑒定[10]

采用細(xì)菌16SrRNA基因的通用引物，引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括：1×PCR緩沖液，1.6mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物各100μmol/L，引物各1.0μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA 1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃，5min；94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。擴(kuò)增引物的合成和16S序列測(cè)定均由華大基因完成。將16S基因序列在GeneBank中進(jìn)行Blast確定其菌屬。系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega5.0軟件的鄰接法（Neighbor-joining method）進(jìn)行；通過自舉分析（Boot-strap）進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

1.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將篩選出的高產(chǎn)蛋白酶菌株接種到100mL液體發(fā)酵培基中，于37℃，150r/min，搖床培養(yǎng)48h，測(cè)定粗酶液中蛋白酶活力，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、氮源、碳源及起始pH值等發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化發(fā)酵條件[11-15]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用SPASS 16.0分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

透明圈法初篩獲得3株有不同大小透明圈的菌株，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩后，C9確定為研究菌株。初篩結(jié)果如圖1所示。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察與生理生化試驗(yàn)

C9菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈藍(lán)紫色，該菌為革蘭氏陽性菌，在LB平板培養(yǎng)菌落近圓形，邊緣不整齊，不透明，表面有褶皺，不光滑，顯微鏡檢菌株具有運(yùn)動(dòng)性。V-P試驗(yàn)呈陰性，甲基紅和吲哚試驗(yàn)均為陽性。

圖1 蛋白酶透明圈Fig.1 Transparent circle of protease

2.2.2 菌株的分子鑒定

測(cè)序結(jié)果在GeneBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，C9菌株16S rRNA序列與芽孢桿菌Bacillus tequilensis16S rRNA序列同源性為98.83%。從圖2系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，該菌株為芽孢桿菌Bacillus tequilensis。

圖2 菌株C9和相關(guān)菌株序列的16S rRNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain C9 and related species constructed by the neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

2.3 產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件的研究

2.3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將C9菌株接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，150r/min旋轉(zhuǎn)搖床，37℃培養(yǎng)6h、12h、24h、48h、54h、60h、72h，測(cè)定蛋白酶活力，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.3 Effect of culture time on protease production of strain

從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24h～48h時(shí)，C9菌株所產(chǎn)蛋白酶活力逐漸上升，在48h酶活力達(dá)到最大值，之后蛋白酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而下降。因此，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h。

2.3.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將接種C9菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基置于37℃、42℃、47℃、52℃、57℃下培養(yǎng)48h，測(cè)定蛋白酶活力，研究溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.4 Effect of culture temperature on protease production of strain

結(jié)果表明，C9菌株所產(chǎn)蛋白酶活力在溫度為37℃～47℃范圍內(nèi)逐漸上升，在47℃時(shí)酶活力達(dá)到最高，隨后酶活力開始下降。

2.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將C9菌株按8%的接種量分別接種在不同起始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)48h后，測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of initial pH value on protease production of strain

發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶有極大地影響，圖5結(jié)果表明，培養(yǎng)基起始pH值過高或過低都會(huì)對(duì)蛋白酶活性產(chǎn)生影響，C9菌株在起始pH值為6.0時(shí)產(chǎn)蛋白酶最佳，所產(chǎn)蛋白酶活性最高。

2.3.4 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5種碳源，按8%的接種量接種后在37℃培養(yǎng)48h，然后測(cè)定粗酶液酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on protease production of strain

對(duì)于產(chǎn)蛋白酶菌株，選擇一種合適的碳源對(duì)提高菌體產(chǎn)酶能力具有重要的作用，因?yàn)楹线m的碳源可以促進(jìn)菌株在培養(yǎng)前期大量增殖，利于后期產(chǎn)酶。而碳源的性質(zhì)和類型是決定產(chǎn)酶成敗的關(guān)鍵之一。圖6結(jié)果表明，麥芽糖為C9菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)碳源，葡萄糖次之。

2.3.5 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5種氮源，按8%的接種量接種在37℃培養(yǎng)48h，測(cè)定粗酶液酶活，結(jié)果見圖7。

圖7 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on protease production of strain

氮源是微生物培養(yǎng)基中不可或缺的組成部分。微生物常用的氮源分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩大類，研究選取了4種無機(jī)氮源和1中有機(jī)氮源進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，硝酸鈉為C9菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)氮源。

2.4 優(yōu)化發(fā)酵條件

通過單因素試驗(yàn)考察了各個(gè)因素對(duì)C9產(chǎn)酶效果的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34），確定其發(fā)酵的主次因素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

由表1可知，綜合培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值3個(gè)因素，培養(yǎng)溫度為影響產(chǎn)酶的主要因素，各因素影響C9菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即主次順序依次為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值。最佳產(chǎn)酶條件為A3B2C1，即該菌株在起始pH值為5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，52℃發(fā)酵培養(yǎng)48h所產(chǎn)蛋白酶活性最高，其活性為41.653U/mL。由表2可知，因素A、B、C的各水平間差異不顯著（p＞0.05），說明培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值在正交設(shè)計(jì)的3水平內(nèi)對(duì)產(chǎn)酶無顯著性影響。因此，確定C9菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳發(fā)酵條件為A3B2C1，既培養(yǎng)溫度為52℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h，起始pH值為5.0。

表1 C9菌株發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment results of C9 strain fermentation condition

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)，確定了C9菌株產(chǎn)生蛋白酶的最佳條件，即在起始pH值為5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，52℃發(fā)酵培養(yǎng)48h時(shí)，具有較高的酶活力41.653U/mL。由極差分析可知，發(fā)酵產(chǎn)酶因素的主次順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值。產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最優(yōu)碳源是葡萄糖，最優(yōu)氮源是硝酸鈉。該菌株不但拓寬了產(chǎn)耐熱蛋白酶的菌種資源，也豐富了耐熱蛋白酶的種類[15-16]。對(duì)其加以改造將有望進(jìn)一步提高蛋白酶活力，為產(chǎn)耐熱蛋白酶菌株在食品、醫(yī)藥、飼料、環(huán)保等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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