龔鋼明，何婷婷，2，高 能

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

亞硝酸鹽還原酶（Nitritereductases）是催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在于傳統(tǒng)腌臘肉制品和腌漬蔬菜中，近年來大量施用氮肥也可導(dǎo)致蔬菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量升高[1-2]。亞硝酸鹽對人體有危害，它能與蛋白質(zhì)代謝物反應(yīng)生成強致癌物亞硝胺。SUNJ等[3]研究發(fā)現(xiàn)0～50mmol/L亞硝酸鈉可以促進胃癌細胞分泌TGF和IL-6等細胞因子，使癌細胞增殖。隨著亞硝酸鹽對人體危害的認識不斷進展，食品中亞硝酸鹽污染狀況及如何防治也成為食品安全問題的熱點之一。利用微生物及其酶降低或消除食物中亞硝酸鹽的研究逐漸受到重視。目前這方面研究較多的是關(guān)于分解亞硝酸鹽的乳酸菌分離及乳酸菌發(fā)酵中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律[4-6]。此外，鄭懷忠等[7]研究了巨大芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)亞硝酸還原酶的條件優(yōu)化和酶在食品中應(yīng)用。NEUBAUERH[8]在發(fā)酵香腸中發(fā)現(xiàn)肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）能通過亞硝酸還原酶還原亞硝酸鹽。JACOBG等[9]從發(fā)酵香腸、煙熏烤腸和腌肉中，篩選出9種可以發(fā)酵產(chǎn)生亞硝酸還原酶的葡萄球菌（Staphylococcus）。但迄今有關(guān)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶基因的的研究報道極少。

論文以植物乳桿菌基因組為模板，擴增出亞硝酸鹽還原酶基因，再連接到表達載體上，經(jīng)鑒定、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達，擬獲得亞硝酸鹽還原酶基因克隆和具有酶活性的重組表達蛋白。這對于研究亞硝酸鹽還原酶性質(zhì)及其應(yīng)用途徑提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、XhoⅠ）購自Fermentas公司；DNA Marker；細菌基因組DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、IPTG購自上海生工生物公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Biomige公司；亞硝酸鹽還原酶總活性檢測試劑盒購于GENMED公司。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）h2由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生物工程實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）TG1、BL21（DE3）；pET-32a（+）質(zhì)粒由天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院提供。

1.1.3 PCR引物

[10-11]，根據(jù)不同類型NiR的保守序列設(shè)計PCR引物，引物序列為：

P1 5′-GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG-3′（下劃線BamHⅠ酶切位點）；

P2 5′-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG-3′（下劃線XhoⅠ酶切位點）。引物由北京六和華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因PCR擴增與重組質(zhì)粒構(gòu)建

提取植物乳酸菌基因組DNA用作模板，加引物P1、P2進行目的基因PCR擴增。反應(yīng)條件為：90℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，45s；30個循環(huán)；72℃，10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化PCR產(chǎn)物，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，與經(jīng)相同限制酶酶切的pET-32a（+）質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行雙酶切、凝膠電泳鑒定和質(zhì)粒PCR、凝膠電泳鑒定，成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-30a（+）-nir-Lp。具體操作分別參照相應(yīng)的產(chǎn)品說明和參考文獻[12]。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達

參照文獻[12]將pET-30a（+）-nir-Lp轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落培養(yǎng)后用PCR鑒定，篩選含質(zhì)粒pET-32a（+）-nir-Lp的陽性菌株以1:100接入LB培養(yǎng)基（含50μg/mL氨芐青霉素），35℃培養(yǎng)至OD600為0.5時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，200r/min繼續(xù)培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)表達。培養(yǎng)液4℃，5000r/min離心15min收集菌體，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為7.4）洗滌2次，再重懸于緩沖液中，用超聲波法破碎細胞，4℃、10000r/min離心15min收集上清液，用SDS-PAGE電泳檢測表達結(jié)果。

1.2.3 粗酶液的活性測定

方法1.2.2中破碎菌體離心收集的上清液即可作為粗酶液。用細菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色法定量檢測試劑盒檢測粗酶液的酶活性。具體操作按照該試劑盒使用說明。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴增

用PCR擴增出亞硝酸鹽還原酶目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示（見圖1），在接近1600bp處出現(xiàn)單一的條帶，該基因初步認定為目的基因擴增產(chǎn)物。

圖1 目的基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of the targeted gene

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物用純化試劑盒純化，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，與載體pET-32a（+）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果中可獲得一個約1600bp插入片段和約6000bp片段（圖2）。這與預(yù)期結(jié)果相符合，表明目的基因已經(jīng)連接到載體pET-32a（+）上。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-32a（+）-nir-Lp。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖Fig.2 Double restriction enzyme digestion of recombinant plasmid

2.3 重組質(zhì)粒表達與目的蛋白鑒定

用重組質(zhì)粒pET-32a（+）-nir-Lp轉(zhuǎn)化的表達菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，制備菌體裂解蛋白的樣品，進行SDS-PAGE電泳分析（圖3），圖中顯示出一個特異性蛋白條帶（箭號所指處），而對照組沒有顯示該特異性條帶。據(jù)此可認重組質(zhì)粒攜帶的基因獲得了表達。所出現(xiàn)的特異性條帶可能是亞硝酸鹽還原酶蛋白。

圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白的表達Fig.3 Analysis of expression of recombinant proteins by SDS-PAGE

2.4 重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物酶活性測定

用細菌亞硝酸鹽還原酶活性檢測試劑盒（GENMED公司）對重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達產(chǎn)物和非誘導(dǎo)表達產(chǎn)物（陰性對照）的酶活性進行測定，結(jié)果見圖4。陰性對照樣品的檢測結(jié)果顯示在0～300s測定時間段OD600值沒有明顯變化，而重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的樣品在測定時間0～300s段，OD600值發(fā)生了明顯變化。這表明重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達產(chǎn)物具有亞硝酸鹽還原酶的活性。該試劑盒檢測原理是亞硝酸鹽還原酶催化NaNO2與還原型甲基紫精（藍色）反應(yīng)生成氧化型甲基紫精（無色）。反應(yīng)液的OD600值大小與還原型甲基紫精和NaNO2的含量稱正比。

圖4 目的基因表達產(chǎn)物的酶活測定結(jié)果Fig.4 Enzyme activity of expression product

3 討論

從研究腌制蔬菜等發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽的變化中發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌具有消除亞硝酸鹽的能力。利用這些菌種人工接種發(fā)酵食品能有效控制腌制品中亞硝酸鹽的含量以保障這類食品安全[13-14]。關(guān)于乳酸菌發(fā)酵消除亞硝酸鹽的機制還沒完全闡明。據(jù)張慶芳等[15]的研究認為乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用分為酶促反應(yīng)和酸反應(yīng)兩個階段，在發(fā)酵初期pH值大于4.5時，亞硝酸鹽降解作用主要是以亞硝酸還原酶的酶促反應(yīng)為主，隨發(fā)酵時間延長，乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸，使培養(yǎng)液pH值降低，當(dāng)pH值小于4.0后，亞硝酸鹽迅速分解，并且這種降解作用隨著pH值的降低而增強，因此推斷在乳酸菌發(fā)酵后期，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主。但OH CK等[16]研究發(fā)現(xiàn)分離自韓國泡菜的植物乳桿菌在發(fā)酵時亞硝酸鹽的消除很大程度上取決于溫度，而不是pH值，乳酸的作用相對較小。從克隆和表達乳桿菌亞硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)基因的角度進行探索。實驗用的植物乳桿菌經(jīng)過鹽酸萘乙二胺法檢測結(jié)果顯示有較強的亞硝酸鹽還原能力[17]。從該菌株基因組中克隆出了假定的亞硝酸鹽還原酶基因，并成功插入到大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)pET-32a（+）載體中。所構(gòu)建了的重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌和IPTG誘導(dǎo)，克隆的目的基因有效表達了重組目的蛋白，對表達菌體蛋白采用了亞硝酸鹽還原酶總活性檢測試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)假定亞硝酸鹽還原酶基因表達的目的蛋白有顯著的還原亞硝酸鹽的功能。據(jù)此認為這個表達蛋白是亞硝酸鹽還原酶。進而表明該乳桿菌基因組中包含有亞硝酸鹽還原酶的基因。實驗結(jié)果可為深入探討植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶奠定重要的基礎(chǔ)。

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