李欣蔚，遲原龍，賈冬英，黃 灝，姚 開*

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.成都大學(xué) 師范學(xué)院，四川 成都 610106）

劍門火腿是以豬后腿為原料在自然或人工控溫條件下進行腌制和長時間發(fā)酵而成的具有特殊風(fēng)味、色澤與質(zhì)地的肉制品，是烹調(diào)美味佳肴的上乘原料，但其在貯藏過程中微生物會繼續(xù)生長繁殖，從而導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)。國內(nèi)外對發(fā)酵肉制品中微生物的種群及其變化已進行了較多研究，李平蘭等[1]發(fā)現(xiàn)宣威火腿中的主要優(yōu)勢菌是葡萄球菌、微球菌和霉菌，且表層數(shù)量明顯多于內(nèi)部；甄宗園等[2]對金華火腿發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的研究顯示，葡萄球菌和乳酸菌是火腿內(nèi)部的優(yōu)勢菌；PAARUPT等[3]研究認為，微球菌是西班牙干腌火腿中數(shù)量最多的微生物?；谠?、工藝和環(huán)境等不同因素會影響發(fā)酵火腿中微生物的組成和比例，加之目前有關(guān)劍門火腿的微生物特性研究尚無報道，因此對劍門火腿的菌相構(gòu)成及其主要腐敗菌的特性進行了分析，其研究結(jié)果可為傳統(tǒng)發(fā)酵火腿的防腐保質(zhì)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

劍門火腿由四川劍閣某火腿廠提供；MSA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)公司提供，生理生化鑒定所用培養(yǎng)基（氧化酶、接觸酶、葡萄糖發(fā)酵、蛋白酶、脂肪酶、耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)粘、產(chǎn)酸、產(chǎn)氨、產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S）的制備方法見參考文獻[4]；其他均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器UV-2000型紫外可見分光光度計，PHS-2C型酸度計等。

1.3 方法

1.3.1 火腿的菌相分析

剔除火腿表面氧化層，分別隨機取火腿表層及其2.0cm以下的肌肉組織，取剪碎后混合的適量樣品，加入定量的無菌生理鹽水，勻漿后進行梯度稀釋。取適當(dāng)稀釋度的菌懸液，分別接入不同選擇性培養(yǎng)基中于適宜條件下進行培養(yǎng)，其中MSA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48h，孟加拉紅培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)96h。對不同選擇性培養(yǎng)基中的典型菌落進行計數(shù)（平行重復(fù)3次，取其平均值）、分離純化、形態(tài)及生理生化特征檢測。

1.3.2 菌株耐鹽性測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于NaCl濃度為9.0%、12%、15%（w/v）的MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.3 菌株耐亞硝酸鹽性測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于含有150mg/kg NaNO2的MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.4 菌株耐酸性測定

將分離得到的葡萄球菌和微球菌分別接種于pH值為4.5的MSA液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.5 菌株產(chǎn)粘能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，接種環(huán)挑取菌落判斷其粘性。

1.3.6 菌株產(chǎn)酸能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，測定其pH值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.7 菌株產(chǎn)氨能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于產(chǎn)氨培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，滴加3～5滴氨試劑，觀察沉淀生成情況，產(chǎn)生黃色或棕紅色沉淀者為陽性，否則為陰性。

1.3.8 菌株產(chǎn)氣能力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，杜氏小管內(nèi)有氣泡產(chǎn)生者為陽性，否則為陰性。

1.3.9 菌株產(chǎn)H2S能力測定

將分離得到的細菌菌株分別穿刺接種于H2S培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d，沿穿刺線產(chǎn)生黑色沉淀的為陽性，否則為陰性。

1.3.10 菌株蛋白酶活力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取0.1mL菌液涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5d，于菌落周圍滴加10%（v/v）三氯乙酸，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈并測其直徑d（d<0.1cm為產(chǎn)酶能力弱，d：0.1cm～0.5cm為產(chǎn)酶能力中等，d>0.5cm為產(chǎn)酶能力強）。

1.3.11 菌株脂肪酶活力測定

將分離得到的細菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取0.1mL菌液涂布于豬背脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈并測其直徑d。

2 結(jié)果與分析

2.1 劍門火腿的菌相構(gòu)成

分別對MSA和MRS培養(yǎng)基上的典型菌落進行分離和純化，依據(jù)BROWN MH等[5]推薦的肉品中微生物的鑒定程序?qū)ζ溥M行生理生化檢測，并對孟加拉紅培養(yǎng)基上的典型菌株進行菌落形態(tài)和個體形態(tài)的觀察。結(jié)果顯示，由MSA培養(yǎng)基分離出3株葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）和1株微球菌（C-1），由MRS培養(yǎng)基分離出2株乳酸菌（L-1和L-2），由孟加拉紅培養(yǎng)基分離出2株霉菌（M-1和M-2）和2株酵母菌（Y-1和Y-2）。

劍門火腿表面和內(nèi)部肌肉組織中的菌相構(gòu)成如圖1所示。可以看出，火腿中微生物主要由葡萄球菌、微球菌和酵母菌構(gòu)成，且表層數(shù)量明顯多于內(nèi)部?；鹜戎忻咕饕植加谄浔砻妫覕?shù)量較少（僅為70cfu/g），結(jié)果與宣威火腿中的霉菌數(shù)量相差較大[1]，這可能與火腿表面氧化層已剔除有關(guān)；火腿表層的細菌主要為葡萄球菌和微球菌，而內(nèi)部主要由葡萄球菌和乳酸菌構(gòu)成，該結(jié)果與李平蘭等[1]和甄宗圓[2]的研究結(jié)論相一致，這是由于火腿表面的高鹽環(huán)境抑制了某些乳酸菌的生長，而火腿內(nèi)部致密的組織和無氧的環(huán)境不利于微球菌生長的緣故；酵母菌在劍門火腿中也占有一定的比例；劍門火腿中基本無腸桿菌檢出，這是由于火腿中的高鹽量（8.5%～9.0%）抑制了腸道菌的生長，或葡萄球菌和乳酸菌對腸桿菌具有一定的限制作用[3]。

圖1 劍門火腿的菌相構(gòu)成Fig.1 Microflora composition in Jianmen ham

2.2 劍門火腿中菌株的耐鹽性

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌于不同NaCl濃度下的生長量見表1?？梢钥闯?，菌株的生長量隨NaCl濃度的增加而降低；3種菌在9.0%NaCl下均有一定生長，但在17%NaCl下僅有葡萄球菌S-1和微球菌C-1生長，且菌株C-1的OD600值僅為0.026，表明其生長很弱。由于劍門火腿的含鹽量為8.5%～9.0%，故在此條件下3種菌都能正常生長，其中葡萄球菌S-1的耐鹽能力最強。

表1 不同NaCl 濃度時菌株的吸光值Table 1 OD600of strains in different concentrations of NaCl

2.3 劍門火腿中菌株的耐亞硝酸鹽能力

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌在NaNO2濃度為150mg/kg下的生長量見表2。可以看出，6株菌均具有一定的亞硝酸鹽耐受性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）對亞硝酸鹽具有較強的耐受性，而微球菌C-1和乳酸菌（L-1和L-2）對亞硝酸鹽的耐受性相對較弱。

表2 含亞硝酸鹽培養(yǎng)液中菌株的吸光值Table 2 OD600of strains in nitrite-containing media

2.4 劍門火腿中菌株的耐酸能力

劍門火腿中葡萄球菌及微球菌于pH值為4.5培養(yǎng)液中的生長量見表3。可以看出，葡萄球菌均具有一定的耐酸性，其中菌株S-1的耐酸性最強；微球菌C-1的耐酸性較差。

表3 pH4.5 培養(yǎng)液中菌株的吸光值Table 3 OD600of strains in pH 4.5 media

2.5 劍門火腿中菌株的致腐特性

劍門火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌的致腐特性見表4?？梢钥闯觯咸亚蚓臀⑶蚓划a(chǎn)粘、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，且產(chǎn)酸能力較弱；葡萄球菌S-3可產(chǎn)蛋白酶，而菌株S-1和S-2及C-1均不產(chǎn)生蛋白酶；葡萄球菌和微球菌都具有產(chǎn)脂肪酶的能力，其中菌株S-2和S-3及C-1具有中等的產(chǎn)脂肪酶能力，這與劉曉強[4]對云南火腿中葡萄球菌和微球菌的主要特性分析結(jié)果基本相同。

表4 劍門火腿中主要細菌的致腐特性Table 4 Spoilage capabilities of main bacteria in Jianmen ham

乳酸菌L-1不產(chǎn)粘，而菌株L-2具有產(chǎn)粘特性；菌株L-1和L-2均不產(chǎn)氨、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，但產(chǎn)酸能力均較強；菌株L-2具有一定的產(chǎn)蛋白酶能力；2株乳酸菌均具有一定產(chǎn)脂肪酶能力，其中菌株L-2的產(chǎn)脂肪酶能力更強。微生物產(chǎn)粘可能是其分解蛋白質(zhì)的緣故，不僅破壞肉品的內(nèi)部組織，而且影響產(chǎn)品外觀，進而造成其腐敗變質(zhì)；而脂肪在微生物產(chǎn)生的脂肪酶作用下發(fā)生水解，也會加速肉品的酸敗變質(zhì)。此外，乳酸菌在同型發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸降低了環(huán)境的pH值，使肉品發(fā)生腐敗而產(chǎn)生酸味[6]。

綜上所述，可以認為劍門火腿中的葡萄球菌S-3及乳酸菌L-2是導(dǎo)致其腐敗的主要微生物。

3 結(jié)論

劍門火腿的菌相是由種類不同的微生物所構(gòu)成。其中，葡萄球菌、微球菌和酵母菌的數(shù)量占優(yōu)，且表層數(shù)量明顯高于其肌肉組織內(nèi)部；乳酸菌主要分布于火腿內(nèi)部，霉菌主要存在于火腿表層。主要細菌的致腐特性分析結(jié)果顯示，葡萄球菌S-3和乳酸菌L-2是導(dǎo)致劍門火腿腐敗的主要菌株。

[1]李平蘭，沈清武，呂燕妮，等.宣威火腿成熟產(chǎn)品中主要微生物菌相構(gòu)成分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15（5）：262-263.

[2]甄宗圓.金華火腿微生物區(qū)系研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.

[3]PAARUP T,NIETO JC,PELAEZ C,et al.Microbiological and physico-chemical characterization of deep spoilage in Spanish dry-cured hams and characterization of isolatedEnterobacteriaceaewith regard to salt and temperature tolerance[J].Eur Food Res Technol，1999，209（5）：366-371.

[4]劉曉強.云南火腿中菌種的分離篩選及在發(fā)酵火腿中的應(yīng)用[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[5]BROWNMH.Meat Microbiology[M].New York:Applied Science Publishers LTD，1982：474-475.

[6]張春江，王海燕，羅 欣.微生物引起的肉與肉制品的腐敗[J].微生物與食品，2001（6）：16-19.