陳 杰，趙雨薇，倪永清，鄭曉吉，史學偉*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.新疆張裕巴保男爵酒莊有限公司，新疆 石河子 832000）

酵母菌是自然界中分布較廣的真菌，因其用途廣泛而引起高度關注。近年來國內對母菌的多樣性研究已涉及到云南的熱帶雨林、秦嶺地區(qū)以及天山極地凍土等[1-3]。西班牙、匈牙利、葡萄牙、意大利和美國伊利湖等國家和地區(qū)對葡萄及葡萄園中酵母菌的多樣性已經(jīng)展開了大量的研究[4]。

酵母菌是葡萄酒品質的靈魂，對于葡萄酒的香氣、色澤、感官質量和風格的影響至關重要，利用不同菌種發(fā)酵而生產出的葡萄酒，其酒質和風味大不一樣。目前，我國在葡萄酒酵母菌的研究和利用等方面還處在起步階段，生產葡萄酒所用的酵母菌種大部分依賴于進口，而用單一菌種接種的純種發(fā)酵會使得葡萄酒失去其特有的香氣和風味[5]。所以對于酵母菌的多樣性和種質的研究，以及及時解決單一菌種的純種發(fā)酵的問題將是以后我國酵母菌研究的重點，并且使用地方的特色菌種來接種發(fā)酵或者與其他接種物混合進行發(fā)酵，生產出具有地方特色的葡萄酒將會是葡萄酒行業(yè)未來的發(fā)展趨勢[6-7]。

新疆地區(qū)具有獨特的氣候和特殊的地理條件，已經(jīng)成為我國優(yōu)質葡萄酒生產最具競爭力的地區(qū)之一。石河子市屬中溫帶大陸性干旱半干旱的氣候，冬季嚴寒，夏季酷熱，日照充足，干燥少雨，蒸發(fā)量大，降水少，溫差較懸殊。

本研究在新疆石河子地區(qū)采集菌株，分離純化后，對可培養(yǎng)酵母菌DNA提取后，用26SrDNA D1/D2和ITS區(qū)序列擴增及檢測，根據(jù)同源性序列來對待測酵母進行分類，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行生物多樣性分析。初步探明我國新疆地區(qū)葡萄釀酒酵母菌的種質多樣性及分類地位，為今后葡萄釀酒酵母菌篩選和育種工作提供寶貴的種質資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑

用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物均購自于TaKaRa公司，相關耐性試驗所用試劑均購自于天津市巴斯夫化學試劑廠，高速冷凍離心機為Eppendorf公司5810R型，PCR儀為Techne公司TC-512型，凝膠成像系統(tǒng)為BioRad公司Gel DOCXR型，水平電泳儀為美國BioRad公司PowerPac Universal型。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

1.2 樣品采集

2010年9月23日采取的葡萄果實及葡萄園土樣（采樣地點：新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗園）。

1.3 菌株的分離與純化

菌株分離純化采用YPD培養(yǎng)基。

菌株分離的方法：將成熟的果粒破碎、帶皮進行自然發(fā)酵。待發(fā)酵啟動后，每日取lmL發(fā)酵液，以不同梯度稀釋夠涂布在YPD培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)48h后，挑取單個菌落，經(jīng)多次平板劃線純化，獲得純培養(yǎng)物（菌株）。純化后的菌株在斜面上進行保存，并存于-20℃冰箱備用[8-9]。

1.4 形態(tài)學的鑒定

酵母菌的常規(guī)鑒定方法依據(jù)《酵母的特征及鑒定手冊》和《微生物分類學》，試驗方法參照《微生物學試驗技術》。

1.4.1 顯微特征

①細胞形態(tài)特征：橢圓形、球形、卵球形、倒卵形、柱狀、棒狀、針形、桿狀、長桿狀、螺旋形、三角形、新月形或其他形狀；

②細胞為單生、對生或群生；

③繁殖方式：單端芽殖、多邊芽殖，兩端芽殖或裂殖。

1.4.2 固體宏觀特征

將活化好的酵母菌株接種在新鮮的YPD平板，在25℃培養(yǎng)1d～7d，觀察并記錄：

①菌落顏色：乳白色、奶油色，橙色、紅色、黃色或粉紅、玫紅；

②菌落質地：奶酪狀，粘稠，松脆或堅韌；

③菌落表面特征：光滑或粗糙、有光澤或暗淡、皺褶、條紋、有突起；

④菌落邊緣：平滑（全緣）、裂葉狀、、蝕刻狀、波浪狀、須狀或根狀；

⑤隆起：菌落平坦或隆起。

1.5 26SrDNA基因PCR擴增和系統(tǒng)進化分析

1.5.1 DNA的提取

用接種環(huán)挑取少量供試酵母菌種，懸浮于100μL裂解液（100mmol/LTris，30mmol/LEDTA，0.5%SDS，pH值為8.0）中，在100℃水浴15min，冷卻之后加入100μL 2.5mol/L醋酸鉀（pH值為7.5），混勻后，置于冰中1h，10000r/min離心10min，取上層清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），劇烈震蕩后，10000r/min離心10min，取上清液，用等體積的氯仿異戊醇重復處理1次，加入相等體積預冷后的異丙醇，混勻后在-20℃靜置15min，并以13000r/min離心15min，沉淀用100μL 70%vol和無水乙醇分別各洗滌1次，真空抽干后加入50μL無菌水，溶解后在-20℃保藏備用[10]。

1.5.2 PCR擴增與測序

使用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3′和NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3′PCR反應體系總體積為50μL，每管中加入10×PCR buffer（Taq buffer with KCl）5μL；25mmol/L的MgCl26μL；10μmol/L引物各2.5μL：10mmol/L dNTPs1μL；Taq酶2.0U，模板DNA 1μL；加雙蒸水至50μL。PCR循環(huán)為95℃、5min，95℃、1min，52℃、2min，72℃、1min，循環(huán)次數(shù)為35次，72℃延伸10min[11]。

1.5.3 PCR擴增產物的測序

PCR產物首先用EZ-10 column PCR Product Purification kit（BIO BASIC INC，Canada）進行純化后，在自動測序儀上進行測序。將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST進行相關序列的搜索查詢，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的近緣菌株的序列進行比較，從數(shù)據(jù)庫獲得相關屬、種的26SrDNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。下載有關的酵母菌菌種的26Sr DNA D1/D2區(qū)序列，將所測得的序列采用CLUSTAL X 1.81軟件對齊序列[12]，采用鄰接法neighborjoining method計算進化距離[13]，用MEGA v.4.0[14]軟件分析進化樹分支模式的穩(wěn)定性，采用bootstrap法，重復次數(shù)為1000，構建進化樹。

2 結果分析

2.1 形態(tài)學特征

以下18個典型菌株分別來自2010年09月23日采樣所得葡萄品種：HES（赫爾松）、DBS（大白桑）、JX（京秀）、MGX（玫瑰香）、BXJ（白香蕉）、MXS-2（馬西斯）、JLN-2（佳麗釀）、HBKT（紅巴克特）、CXZ（赤霞株）、QHWE-4（齊哈維爾）、BLS-2（布列沙）、HZMT（黑扎馬特）、HQLM-2（黑齊良母）、ZZ-3（雜株）、SFR-3（賽芙蓉）、JLWSM-1（捷萊烏蘇姆）、XMO（西米奧）、BYM（白玉覔）、WDLT（沃德里特）。按照菌落形態(tài)（形狀、大小、高度、顏色、濕潤、光澤、透明度、邊緣、表面形態(tài)）和細胞形態(tài)（圓形、橢圓形、檸檬形、半月形細胞，出芽或裂殖等）初步分為11類，見表1。

表1 酵母菌株的分類Table 1 Classification of yeast

2.2 酵母菌的DNA提取

采用酵母菌DNA微量提取法從純化后的酵母菌株中提取基因組DNA，其純度、濃度和完整性能滿足PCR擴增反應和測序要求。

2.3 26SrDNA D1/D2區(qū)擴增

擴增產物經(jīng)電泳檢測片段在500bp～750bp之間，符合酵母菌26SrDNA D1/D2區(qū)理論預期值（約為600bp），如圖1。

2.4 基于26SrDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

將26株酵母菌株所獲得的26SrDNA D1/D2區(qū)域序列提交NCBI，通過Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已發(fā)表的26SrDNA D1/D2區(qū)域序列進行同源性比較（表2），構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），在基于26SrDNA D1/D2區(qū)域序列分析繪制的系統(tǒng)樹上，相同的種被歸在一個主分枝內，表明其具有較近的親緣性，而不同的種卻在于不同的亞分枝上，顯示其在D1/D2區(qū)域序列上具有明顯區(qū)別。

圖1 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.1 Agarose jel electrophoresis detection result of PCR amplification product

圖2 基于26S rDNA 序列的26株酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 26 yeast strains based on partial 26S rDNA sequences

表2 分離菌株依據(jù)26SrDNA D1/D2 序列鑒定結果Table 2 Identification of the yeast strains based on sequence analysis of the 26S rDNAD1/D2

3 討論

本研究中，在新疆石河子地區(qū)采集野生酵母菌84株，通過細胞核菌落形態(tài)及26SrDNAD1/D2區(qū)域序列的測定等方法，對所分離的菌株進行系統(tǒng)的分類及鑒定研究。得到以下結論：

（1）鑒定結果發(fā)現(xiàn)所有菌株屬于6個屬，分別為：假絲酵母屬（Candida）、Meyerozyma屬、紅酵母屬（Rhodotorula）、孢漢遜屬（Hanseniaspora）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母屬（Pichia），共有10個種，其中包括6個疑似種。

（2）新疆擁有獨特的地理環(huán)境和氣候，孕育出很多獨特的動植物和微生物。本研究中發(fā)現(xiàn)了6株與GenBank已有模式菌株序列同源率低的酵母菌分別是Y2與Galactomyces geotrichumJN083822.1的同源率為98%，Y3與RhodotorulamucilaginosaGU373744.1的同源率為97%，Y4與MeyerozymaguilliermondiiHM988720.1的同源率為98%，Y5與Candida amapaeEU057556.1的同源率為98%，Y6和Y7與HanseniasporauvarumGU080043.1、HM988683.1的同源率為98%和97%等。根據(jù)Kurtzman酵母種類的劃分依據(jù)，同源相似率低于99%的，不能劃為同一個種，因此對于這些待鑒定的菌株可以初步認定其是一個新種，有待進一步的形態(tài)、生殖方式及生理生化鑒定結果的考證。

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