劉海臣，劉 猛，鄭其鑫

（1.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院,江蘇 徐州 221116;2.陜煤集團銅川礦業(yè)公司，陜西 銅川 727000）

人類面臨著能源危機和環(huán)境污染危機的雙重挑戰(zhàn)，如能將大量的農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖進而制備纖維素乙醇意義重大。由于秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維素被木質(zhì)素和半纖維素緊緊包圍，具有高結(jié)晶度和難溶性等特點，這使其與催化劑或酶的接觸困難，不易水解。需要適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法來解決秸稈纖維素不易水解的難題，當(dāng)前文獻報道的多數(shù)預(yù)處理方法成本偏高，且有可能造成二次污染[1-8]。

以稻草秸稈為原料，從機械粉碎、微波處理等方面研究了預(yù)處理對稻草粉酶解的影響。由于微波加熱時間與微波功率之間交互影響較大[9-10]，故采用響應(yīng)面分析法來確定微波預(yù)處理方法下的最優(yōu)條件，為稻草粉預(yù)處理提供了一個新的研究方向。其中微波預(yù)處理是本研究的重點，該法與蒸汽爆破法及酸堿法相比具有節(jié)能環(huán)保，生產(chǎn)效率高的優(yōu)點[11-15]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稻草秸稈：取自中國礦業(yè)大學(xué)文昌校區(qū)附近農(nóng)家，經(jīng)烘干粉碎篩分后測量主要成分為纖維素35.4%，半纖維素25.6%，木質(zhì)素12.8%，灰分13.2%，其他組分13.0%，與其均值相差不大。

纖維素酶：活力單位15000U/g，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 還原糖濃度的測定方法

還原糖濃度的測定：從不同預(yù)處理方法處理過的稻草粉樣品中，分別稱取0.05g樣品，加入試管中，然后依次加入2.5mL酶活單位為30U/mL的纖維素酶溶液和2.5mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液。接著將其放入設(shè)置條件為50℃、150r/min的恒溫水浴搖床中，酶解1h。最后將酶解液用濾紙快速過濾，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定酶解液中的還原糖濃度。

1.2.2 試驗方法

將稻草粉烘干后，用粉碎機進行粉碎，然后用篩子分別篩出20目以下、20目（830μm）～32目（500μm）、32目（500μm）～60目（250μm）、60目（250μm）～120目（120μm）、120目以上5個粒徑級別。測5種不同粒徑大小下稻草粉對應(yīng)的還原糖濃度（CRed），確定最佳的粉碎粒徑。

取32目（500μm）～60目（250μm）粒徑的稻草粉，對液固比、微波功率、微波加熱時間3個因素進行研究。采用的微波爐為格蘭仕WD800G，其輸出功率800W，有5種火力調(diào)節(jié)，分別為20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）。

采用響應(yīng)面分析法研究微波加熱時間與微波功率之間的交互影響，確定微波預(yù)處理方法下的最適條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 機械粉碎預(yù)處理對稻草粉酶解效果的影響

分別稱取目數(shù)小于20目（830μm）、20目（830μm）～32目（500μm）、32目（500μm）～60目（250μm）、60目（250μm）～120目（120μm）、大于120目（120μm）的5種粒徑級別的稻草粉樣品0.05g樣品，根據(jù)上述實驗方法測定不同粒徑下的還原糖濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 機械粉碎對稻草粉酶解的影響Fig.1 Effect of mechanical crushing on enzymatic hydrolysis of rice straw cellulose

由圖1可以看出，隨著稻草粉粒徑目數(shù)的增加，稻草粉酶解效果增加明顯，還原糖濃度增幅較大。機械粉碎主要是通過兩方面來提高纖維素的酶解效果：一是秸稈經(jīng)粉碎處理后，木質(zhì)素、半纖維素與纖維素的結(jié)合層被破壞，三者的聚合度降低，纖維素的結(jié)晶度減少，故反應(yīng)性能和水解糖化率提高；二是隨著機械粉碎的力度加大，秸稈的粒徑減小、相對表面積增大，裸露在外的可供纖維素酶結(jié)合的位點增加，由米氏方程知，酶解速度與位點數(shù)成正比，故酶促反應(yīng)速度增大。

雖然機械粉碎處理對秸稈效果明顯，但顆粒過小對后續(xù)的洗滌和過濾不利，故后續(xù)試驗采用的粉碎粒度為60目。單純依靠機械粉碎難以達到預(yù)期的糖化效果，需與其他的預(yù)處理方法聯(lián)合使用（如微波預(yù)處理方法）。

2.2 液固比對微波預(yù)處理效果的影響

將不同液固比的稻草粉經(jīng)320W的微波處理的6min后，洗滌、過濾、烘干、酶解，測還原糖，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨著液固比的增加，稻草粉酶解效果增加，還原糖濃度增大。當(dāng)液固比達到30:1時，還原糖濃度達最大值。這說明液固比也是影響微波預(yù)處理效果的一個主要因素，若液固比太小，玻璃瓶中的液體迅速蒸干，稻草中的纖維素成分發(fā)生焦化，導(dǎo)致酶解還原糖量的下降；若液固比太大時，微波產(chǎn)生的熱量有很大一部分被水吸收，影響微波對稻草粉作用的效果。

2.3 微波功率對微波預(yù)處理效果的影響

在液固比為30:1，微波加熱時間為6min時，將微波功率分別設(shè)置為20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）進行處理。結(jié)果見圖3。

圖2 經(jīng)微波處理后不同液固比對還原糖濃度的影響Fig.2 Effect of ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar after microwave pretreatment

由圖3可以看出，當(dāng)微波功率為320W時，還原糖濃度最大，其實最適宜微波功率并不是一個固定值，與微波加熱時間存在著交互影響。即微波加熱時間越短，微波最佳功率越大；反之，微波加熱時間越長，微波最佳功率越小。微波功率較低作用時間較短時，微波對稻草粉纖維素的結(jié)晶度影響不大，而微波功率較高作用時間較長時，稻草中的纖維素成分發(fā)生焦化，導(dǎo)致酶解還原糖量的下降。

2.4 微波加熱時間對微波預(yù)處理效果的影響

在液固比為30:1，微波功率為40%（320W）時，將微波加熱時間分別設(shè)置為2min、4min、6min、8min、10min進行處理，結(jié)果見圖4。

圖4 不同微波加熱時間對還原糖濃度的影響Fig.4 Effect of microwave heating time on concentrations of reducing sugar

由圖4可以看出，當(dāng)微波功率設(shè)定為320W時，微波最佳加熱時間為6min。較短或較長的作用時間都會導(dǎo)致酶解還原糖量的下降。

2.5 微波功率和加熱時間的協(xié)同作用對稻草粉酶解效果的影響

研究了微波功率和微波加熱時間對稻草粉酶解效果的影響，分別在20%（160W）、40%（320W）、60%（480W）、80%（640W）、100%（800W）5種火力下處理3min、6min和9min，酶解后測還原糖濃度（CRed）結(jié)果見圖5。

圖5 微波加熱時間與功率對還原糖濃度的影響Fig.5 Effect of microwave heating time and power on concentrations of reducing sugar

由圖5可以看出，微波功率和微波加熱時間是影響稻草預(yù)處理效果的2個重要的因素。每個加熱時間都有對應(yīng)的最佳微波功率，此時有最高酶解CRed。其中，320W處理6min得到的CRed最高，為352.35μg/mL，與未經(jīng)微波處理過60目的稻草粉（237.43μg/mL）相比，CRed提高了48.40%。另外，800W處理3min得到的CRed也很高。

2.6 微波預(yù)處理稻草秸稈優(yōu)化條件的確定

根據(jù)Box—Behnken設(shè)計原則，選取液固比、微波功率、微波加熱時間3個對微波預(yù)處理影響較顯著的因素，以還原糖濃度（μg/mL）為響應(yīng)值，得到的試驗數(shù)據(jù)見表1。

運用Design—Expert8.0.5軟件對表1數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合得到回歸方程：Y=352.60-6.25A+5.55B-4.95C+0.29AB+0.090AC-30.69BC-33.12 A2-25.00B2-30.15C2（其中，Y為還原糖濃度，A為液固比，B為微波功率，C為微波加熱時間）。由分析結(jié)果（見表2）可知，模型的值為11.43，p<0.01，表現(xiàn)為顯著；失擬項為0.0534，表現(xiàn)為不顯著；復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9763，說明該方程擬合度良好。

上述二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖6～圖8。從圖6～圖8可以看出：液固比（X:1）、微波加熱時間（min）、微波功率等3因素的二階模型及其交互作用對還原糖濃度的影響非常明顯，當(dāng)某一因素固定時，隨著其他2個因素的增大，還原糖濃度的得率增加迅速，達到峰值后有所降低。對3因素二階模型及其交互作用影響還原糖濃度情況進行分析評價，得到最佳的工藝參數(shù)為液固比29.07:1、微波加熱時間5.23min、微波功率287.84W。

表1 基于Box-Behnken 設(shè)計的試驗結(jié)果Table 1 The results based on Box-Behnken design

表2 微波預(yù)處理稻草秸稈的響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis on rice straw by microwave pretreatment

求得的最優(yōu)點為二階模型的最大值。該值是否最優(yōu)，還需經(jīng)試驗驗證。為使試驗更具操作性，故將液固比調(diào)整為29:1，微波加熱時間5min，微波功率320W，此時還原糖濃度為360.5μg/mL，與只經(jīng)機械粉碎時的237.4μg/mL相比，其還原糖濃度提高了51.8%。

另外，借助F值還可以判斷各因素對微波預(yù)處理稻草秸稈的影響程度，F(xiàn)值越大，表明其影響程度越大。各因素對微波預(yù)處理水稻秸稈的影響次序為：微波功率和微波加熱時間的交互作用>液固比>微波加熱時間>微波功率。

圖6 微波加熱時間和液固比對還原糖濃度的影響Fig.6 Effect of microwave heating time and ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar

圖7 微波功率和液固比對還原糖濃度的影響Fig.7 Effect of microwave power and ratios of liquid and solid on concentrations of reducing sugar

圖8 微波火力（功率）和微波加熱時間對還原糖濃度的影響Fig.8 Effect of microwave power and microwave heating time on concentrations of reducing sugar

3 結(jié)論

研究了稻草秸稈的預(yù)處理，首次通過響應(yīng)面分析法對微波預(yù)處理稻草秸稈進行了條件優(yōu)化，并對諸因素影響的顯著性進行了分析。

研究發(fā)現(xiàn)微波功率和微波加熱時間的交互影響較為明顯，采用了響應(yīng)面分析法對其進行了的優(yōu)化。微波預(yù)處理稻草秸稈的影響次序為：微波功率和微波加熱時間的交互作用>液固比>微波加熱時間>微波功率。得到的最佳優(yōu)化條件為液固比29:1、微波加熱時間5min、微波功率320W，此時還原糖濃度為360.5μg/mL，為研究結(jié)果中最高，該結(jié)果與只經(jīng)機械粉碎時的237.4μg/mL相比其還原糖濃度提高了51.8%。

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