摘 要 建立了MAX混合陰離子固相萃取柱凈化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中伏馬菌素FB1和FB2及其水解代謝產(chǎn)物HFB1和HFB2的方法。牛奶樣品經(jīng)水稀釋后，經(jīng)MAX柱直接凈化，甲醇洗脫得到FB1和FB2，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子掃描測定，1%乙酸甲醇洗脫得到HFB1和HFB2，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜正離子掃描測定。結(jié)果表明，添加濃度為0.l～5.0

SymbolmA@ g/L，牛奶中FB1和FB2及其水解代謝產(chǎn)物的回收率為76.4％～92.3％；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝5） 為5.9％～12.5％；方法檢出限（LOD） 均為0.03

SymbolmA@ g/L；定量限（LOQ） 均為0.1

SymbolmA@ g/L。本方法操作簡單，靈敏度、回收率和重復(fù)性均良好。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞 [HTSS]牛奶； 伏馬菌素； 水解代謝產(chǎn)物； 固相萃??； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110711收稿；20111228接受

本文系浙江省分析測試基金（No.2007F70026）及2010年浙江省\"三農(nóng)五方\"科技協(xié)作計(jì)劃資助項(xiàng)目

* Email: qianmingrong@yahoo.com.cn.

[HT]

1 引 言

伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）是一類主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，其中FB1（C34H59O15N，圖1）和FB2（C34H59O14N，圖1）是污染食品和飼料的主要成分，也是FB誘發(fā)食道癌、肝癌、胃癌等疾病的主要原因。FB在農(nóng)產(chǎn)品中污染范圍較廣，在玉米\\[1，2\\]、

紅酒\\[3\\]、啤酒\\[4\\]、蘆筍\\[5\\]、牛奶\\[6\\]等中有不同程度的檢出。目前尚未有牛奶中FB限量的規(guī)定，歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FB（含F(xiàn)B1和FB2）的限量為0.2 mg/kg\\[7\\]，但研究報(bào)道低濃度FB與其它毒素如黃曲霉毒素會(huì)產(chǎn)生協(xié)同毒害作用\\[8\\]。 FB水解失去碳骨架14和15位的 [TS（][HT5”SS] 圖1 FB1（R1＝OH）， FB2（R1＝H）的結(jié)構(gòu)式

Fig．1 The structure of fumonisin B1 （FB1） and FB2[HT][TS）]

[TS（][HT5”SS] 圖2 HFB1（R1＝OH）， HFB2（R1＝H）的結(jié)構(gòu)式

Fig．2 The structure of hydrolysed fumonisin B1 （HFB1） and HFB2[HT][TS）]丙三羧酸基團(tuán)后生成脫丙三羧酸伏馬菌素 （Hydrolysed fumonisin B， HFB），HFB1和HFB2（結(jié)構(gòu)式見圖2）能抑制神經(jīng)鞘氨醇的合成\\[9\\]。Pagliuca等\\[10\\]測定了豬肝中的FB1和HFB1，Gazzotti等\\[11\\]測定了豬肝中的FB1， FB2， HFB1和HFB2。尚未見牛奶中FB和HFB同時(shí)測定的報(bào)道。牛奶消費(fèi)群體廣、數(shù)量大，檢測其可能含有的FB及其水解代謝物的殘留量對(duì)評(píng)價(jià)牛奶安全和保障人體健康有重要意義。

測定農(nóng)產(chǎn)品或食品中低濃度的FB和HFB，要求方法具有較高靈敏度，前處理一般需要濃縮富集凈化。文獻(xiàn)報(bào)道的前處理技術(shù)有免疫柱凈化\\[6\\]， HLB\\[12\\]柱凈化、陽離子柱凈化\\[13\\]和陰離子柱凈化\\[5，14\\]，測定方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金法\\[15，16\\]、經(jīng)鄰苯二甲醛和巰基乙醇衍生后高效液相色譜熒光測定法\\[10，13，14\\]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\\[5，6，11，12\\]。本實(shí)驗(yàn)基于牛奶（pH≈7）中FB1和FB2的羧基發(fā)生電離，主要以呈負(fù)離子形式存在，HFB1和HFB2以分子形式存在，故采用陰離子反相混合MAX柱子同時(shí)凈化FB1， FB2和其水解代謝產(chǎn)物，并運(yùn)用高選擇性和高靈敏度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。結(jié)果表明，F(xiàn)B1和FB2在串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子反應(yīng)監(jiān)測模式下背景值低于正離子模式，HFB1和HFB2正離子模式下響應(yīng)值遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式，因此采用負(fù)正兩種電離模式分別測定伏馬菌素和水解代謝物。4種化合物的方法定量限達(dá)到 0.1

SymbolmA@ g/L，能滿足牛奶中FB1， FB2及其水解產(chǎn)物測定的需要。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：TSQ Quantum配surveyor液相操作系統(tǒng)（美國Thermo Fisher scientific公司）；Synergi Hydro RP 色譜柱（150 mm×2.0 mm，3

SymbolmA@ m， 美國Phenomenex公司）；Sorvall Primo R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Nanosep GHP超濾濃縮離心管（0.45

SymbolmA@ m，美國PALL公司）；HLB柱（200 mg，6 mL，美國Waters公司）；MAX柱（150 mg，6 mL，美國Waters公司）。甲醇（色譜純，美國Merck公司）；甲酸和乙酸（色譜純，美國Tedia公司）；標(biāo)準(zhǔn)品FB1（＞98%）和FB2（＞98%）購自德國Sigma公司。分別準(zhǔn)確稱取5.00 mg FB1或FB2， 用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成200 mg/L儲(chǔ)備液。

HFB1和HFB2的制備：取0.5 mL 200 mg/L的FB1或FB2甲醇溶液，加入10 mL 1 mol/L KOH溶液，70 ℃孵育1 h，冷卻至室溫，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5\\[10\\]。轉(zhuǎn)移溶液至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的HLB柱，5 mL水洗后，抽干，5 mL甲醇洗脫，并用甲醇定容至5.0 mL，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜確定無FB1或FB2殘留。HFB1和HFB2的濃度分別為11.2和11.0 mg/L，溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化和稀釋后用于添加回收實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

吸取10.0 mL 牛奶于50 mL離心管中，加入10 mL水稀釋，轉(zhuǎn)移至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的MAX柱，5 mL水洗滌、5 mL甲醇洗脫并收集，再用5 mL 1%乙酸甲醇洗脫并收集，氮?dú)獯蹈珊?，分別加入200

SymbolmA@ L甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，振蕩渦旋15 s后轉(zhuǎn)移至超濾濃縮離心管中，以1000 r/min離心3 min后，取濾液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

用甲醇配制濃度為0.5和0.05 mg/L的FB1， FB2， HFB1和HFB2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在空白牛奶中進(jìn)行4個(gè)添加濃度水平的回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行5次：10.0 mL牛奶中分別添加0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20和100

SymbolmA@ L，添加0.05 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20和100

SymbolmA@ L，靜置1 h后按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱柱溫: 30 ℃; 進(jìn)樣量：20

SymbolmA@ L；流動(dòng)相：甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，流速：0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子掃描，噴霧電壓：

Symbolm@@ 3000 V；正離子掃描，噴霧電壓：4000 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；碰撞氣氬氣：1.5×10

Symbolm@@ 3 torr（11.2×10

Symbolm@@ 6 Pa）。定量和定性離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見表l。在此條件下，F(xiàn)B1和FB2保留時(shí)間分別為2.9和4.3 min。HFB1和HFB2保留時(shí)間分別為3.0和4.1 min。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期錢鳴蓉等： 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中伏馬菌素FB1和FB2及其水解代謝物 

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定伏馬菌素一般采用正離子模式\\[5，6，11，12\\]。本實(shí)驗(yàn)采用“T”三通方式，分別在負(fù)正離子模式下對(duì)FB1， FB2及其水解代謝產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，F(xiàn)B1和FB2濃度均為10 mg/L。正離子模式下，以甲醇0.1%甲酸溶液（50∶50， V/V）為流動(dòng)相，F(xiàn)B的響應(yīng)約為1×107，\\[M＋H\\]＋通過丟失TCA（HOCOCH2 CH（COOH）CH2COOH）和H2O裂解產(chǎn)生碎片\\[M＋H－2TCA－H2O\\]＋， \\[M＋H

Symbolm@@ 2TCA－2H2O\\]＋， \\[M＋H－TCA－H2O\\]＋ \\[10\\]，F(xiàn)B1主要生成m/z 352， 334和528，F(xiàn)B2主要生成m/z 336， 318和512。負(fù)離子模式下，以甲醇水（50∶50， V/V）為流動(dòng)相，F(xiàn)B1或FB2 的\\[M

Symbolm@@ H\\]

Symbolm@@ 響應(yīng)約為2×106，主要由TCA基團(tuán)與骨架相連的羧基發(fā)生斷裂產(chǎn)生碎片離子\\[OCOCH2CH（COOH）CHCO\\]

Symbolm@@ 和\\[M－H－HOCOCH2CH（COOH）CHCO\\]

Symbolm@@ ，其中FB1裂解生成m/z 157和562，F(xiàn)B2裂解生成m/z 157和546。



本實(shí)驗(yàn)在FB1和FB2添加濃度均為0.1

SymbolmA@ g/L的條件下，分別在正負(fù)電離模式下進(jìn)行反應(yīng)離子監(jiān)測掃描，分別以響應(yīng)值最高和次高的離子對(duì)用于定量和定性分析，其中正離子模式下FB1的定量與定性離子對(duì)分別為m/z 722.4/334， 722.4/352，F(xiàn)B2的定量與定性離子對(duì)分別為m/z 706.4/318， 706.4/336。在正離子模式下，背景響應(yīng)值較高，雜質(zhì)易對(duì)低濃度FB1的定量產(chǎn)生干擾；在負(fù)離子模式下，背景響應(yīng)值遠(yuǎn)低

[LM][HT5”SS][*4]表1 伏馬菌素FB1， FB2和脫丙三羧酸伏馬菌素HFB1， HFB2的質(zhì)譜條件參數(shù)

Table 1 LCMS/MS parameters for fumonisin B1， B2and hydrolysed fumonisin B1， B2

[HT6SS][BG（][BHDFG４，WK16，WK8*2。2，WK14，WK10W]名稱Name分子量

Molecular weight電離模式Mode定性與定量離子對(duì)

Ion pairs for quantification

and confirmation碰撞能量Collision energy（eV）

伏馬菌素 B1

Fumonisin B1721.4－720.4/157*

720.4/5623830

伏馬菌素 B2

Fumonisin B2705.4－704.4/157*704.4/54638

29

脫丙三羧酸伏馬菌素B1

Hydrolysed fumonisin B1405.3＋406.3/388*406.3/37015

14

脫丙三羧酸伏馬菌素B2

Hydrolysed fumonisin B2389.3＋390.3/336*390.3/35419

14[BHDFG3，WKZQ0W] *：表示用于定量分析的離子對(duì)（Ion pairs with asterisk are used for quantification）。[BG）W][HT][]

于待測物響應(yīng)值，無明顯雜質(zhì)峰，信噪比高（圖3A），因此本實(shí)驗(yàn)選擇在負(fù)離子模式測定牛奶中FB1和FB2。

HFB1和HFB2在負(fù)離子模式下無明顯響應(yīng)，在正離子模式下反應(yīng)離子碎片由\\[M＋H\\]＋失去1、2或3個(gè)H2O生成。正離子模式下，0.1

SymbolmA@ g/L的添加回收的提取離子流色譜圖見圖3B。

[TS（][HT5”SS]圖3 牛奶中添加濃度為0.1

SymbolmA@ g/L，負(fù)離子模式下FB1和FB2的提取離子流色譜圖（A）， 正離子模式下HFB1和HFB2的提取離子流色譜圖（B）

Fig．3 Extraction ion chromatograms of FB1 and FB2 detected in negative mode （A）， HFB1 and HFB2 detected in positive mode （B） spiked at 0.1

SymbolmA@ g/L in milk[HT][TS）]

3.2 凈化條件與色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)測定市場不同品牌的15個(gè)牛奶樣品，pH均約為7。FB1和FB2含有2個(gè)TCA，為酸性化合物，在牛奶樣品中主要以負(fù)離子形式存在；HFB1和HFB2不含有羧酸基團(tuán)，主要以分子形式存在。將牛奶用水稀釋后上柱，F(xiàn)B與MAX交換柱上的陽離子基團(tuán)結(jié)合，HFB通過反相作用保留于MAX柱上，水洗滌去除雜質(zhì)后，用甲醇洗脫HFB，酸化甲醇使FB成分子形態(tài)同時(shí)被洗脫。

酸性化合物FB1和FB2在水中電離，以甲醇水為流動(dòng)相時(shí)，兩種FB在色譜柱上的峰形嚴(yán)重拖尾。在流動(dòng)相中加酸可抑制FB的電離、改善峰形，但酸濃度過高會(huì)抑制FB在負(fù)離子模式下的離子化效率、降低靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分析了甲醇和水相比例為75∶25（V/V），水相中甲酸濃度為0.05%， 0.1%和0.2%時(shí)FB的響應(yīng)值和峰形，當(dāng)甲酸濃度為0.1%時(shí)，峰形對(duì)稱且響應(yīng)值較高，背景值較低；含有甲酸的流動(dòng)相有助于提高HFB在正離子模式下的質(zhì)子化電離效率。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)與線性范圍

用流動(dòng)相稀釋一系列FB1， FB2， HFB1和HFB2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1， 5， 10， 20， 50和100

SymbolmA@ g/L。同時(shí)按照2.2節(jié)處理空白牛奶樣品配制相同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值可以反應(yīng)基質(zhì)干擾作用強(qiáng)弱。由圖4可見，F(xiàn)B1， HFB1和HFB2有一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)，斜率之比分別為0.84， 0.83和0.91，F(xiàn)B2無明顯基質(zhì)干擾作用，為使定量分析更準(zhǔn)確，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

[TS（][HT5”SS]圖4 FB1（A）， FB2（B）， HFB1（C）和HFB2（D）在溶劑標(biāo)（■）和牛奶基質(zhì)標(biāo)（▲）中的濃度峰面積線性回歸曲線

Fig．4 Linear regression curves for FB1（A），F(xiàn)B2（B），HFB1（C） and HFB2（D） in solvent（■） and milk matrix（▲）[HT][TS）]

3.4 方法的回收率、精密度和靈敏度

在空白牛奶中添加含F(xiàn)B1， FB2， HFB1和HFB2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為0.1， 0.5， 1.0和5.0

SymbolmA@ g/L，方法回收率和精密度見表2。

在實(shí)驗(yàn)色譜質(zhì)譜條件下，分析平行操作5次、添加濃度為0.1

SymbolmA@ g/L的FB1， FB2， HFB1和HFB2的分子離子峰圖譜。分別以噪音信號(hào)的3倍和10倍計(jì)算方法的檢出限和定量限。FB1， FB2， HFB1和HFB2的方法檢出限（LOD）為0.03

SymbolmA@ g/L，定量限（LOQ）為0.1

SymbolmA@ g/L。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表2 方法添加回收率和精密度（n＝5）

Table 2 Recovery and precision of method（n＝5）

[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK7*2，WK12，WK*2，WK12，WK*2，WK12，WK*2，WK12W]添加水平

Fortification

level （

SymbolmA@ g/L）FB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）FB2回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB2回收率

Recovery （%）RSD（%）

0.180.58.478.610.379.46.776.412.5

0.586.57.682.68.4 81.69.385.78.4

191.26.789.27.785.45.982.49.7

588.29.183.59.4 92.37.785.16.8

[BG）Ｗ][HT][]

3.5 實(shí)際樣品的檢測

隨機(jī)抽取市場上6個(gè)不同品牌牛奶15個(gè)樣本，測定FB1， FB2， HFB1和HFB2含量。在某品牌牛奶中檢出FB1，含量為（0.18±0.013）

SymbolmA@ g/L （n＝3），其它未有檢出。與文獻(xiàn)\\[6\\]檢測出的牛奶樣品中FB1平均濃度0.6

SymbolmA@ g/L相當(dāng)。

本方法能滿足牛奶中伏馬菌素及其水解代謝物檢測的要求，為進(jìn)一步分析牛奶中真菌毒素的污染水平和安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

References

1 Silva L J G， Lino C M， Pena A， Molto J C. Food Addit. Contam.， 2007， 24（4）: 381～390

2 Ren Y P， Zhang Y， Han S Y， Han Z， Wu Y N. Anal. Chim. Acta， 2011， 692（12）: 138～145

3 Mogensen J M， Larsen T O， Nielsen K F. J. Agric. Food Chem.， 2010， 58（8）: 4853～4857

4 RomeroGonzalez R， Vidal J L M， AguileraLuiz M M， Frenich A G. J. Agric. Food Chem.， 2009， 57（20）: 9385～9392

5 LIU ChengLan， XU WenNa， LIU FengMao， PAN CanPing， XU YanJun， JIANG ShuRen. Chinese J. Anal. Chem.，2005，33（11）： 1619～1622

劉承蘭， 許文娜， 劉豐茂， 潘燦平， 徐彥軍， 江樹人. 分析化學(xué)， 2005， 33（11）： 1619～1622

6 Gazzotti T， Lugoboni B， Zironi E， Barbarossa A， Serraino A， Pagliuca G. Food Control， 2009， 20（12）： 1171～1174

7 Commission of theEuropean Communities. Official Journal of the European Union， 2006， L364： 5～24

8 Gelderblom W C A， Marasas W F O， LebepeMazur S， Swanevelder S， Vessey C J， Hall P dela M. Toxicology， 2002， 171（23）： 161～173

9 Seiferlein M， Humpf H U， Voss K A， Sullards M C， Allegood J C， Wang E， Merrill AH Jr. Mol. Nutr. Food Res.， 2007， 51 （9）： 1120～1130

10 Pagliuca G， Zironi E， Ceccolini A， Matera R， Serrazanetti G P， Piva A. J. Chromatogr. B， 2005， 819（1）： 97～103

11 Gazzotti T， Zironi E， Lugoboni B， Barbarossa A， Piva A， Pagliuca G. Food Chem.， 2011， 125（4）： 1379～1384

12 Sorensen L K， Elbak T H. J. Chromatogr. B， 2005， 820（2）： 183～196

13 Lino C M， Silva L J G， Pena A L S， Silveira M I. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（5）： 1214～1220

14 De Girolamo A， Pereboomde Fauw D， Sizoo E， van Egmond H P， Gambacorta L， Bouten K， Stroka J， Visconti A， Solfrizzo M. World Mycotoxin J.， 2010， 3（2）： 135～146

15 Wang S， Quan Y， Lee N， Kennedy I R. J. Agric. Food Chem.， 2006， 54（7）： 2491～2495

16 Quan Y， Zhang Y， Wang S， Lee N， Kennedy I R. Anal. Chim. Acta， 2006， 580（1）： 1～8

Determination of Fumonisins B1， B2 and Their Hydrolysed Metabolites in

Bovine Milk by Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry



QIAN MingRong*1， WU LiQin1， ZHANG Hu1， LIU Fei2， LI Rui1， CHEN ZhiMin1， FANG LiZhen1

1（Zhejiang Province Key Lab for Food Safety， Institute of Quality and Standard for Agroproducts，

Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Hangzhou 310021， China）

2（ThermoFisher Scientific （Shanghai）， Shanghai 201206， China）



Abstract MAX column combined with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry was used to determine fumonisins B1（FB1）， FB2 and their hydrolysed metabolites in bovine milk. After 10 mL milk was diluted with 10 mL water， it was directly transferred to MAX column for purification. FB1 and FB2 were eluted with methanol and detected with HPLCMS/MS in negative mode. The hydrolysed metabolites hydrolysed fumonisins B1（HFB1） and HFB2 were eluted with methanol containing 1% acetic acid and detected with HPLCMS/MS in positive mode. The recoveries for four compounds were 76.4%－92.3% at fortification levels of 0.1－5

SymbolmA@ g/L in bovine milk and relative standard deviation was in the range of 5.9%－12.5%. The LOD was 0.03

SymbolmA@ g/L and LOQ was 0.1

SymbolmA@ g/L for FB1， FB2 and their hydrolysed metabolites. This method is simple， sensitive， and repeatabilities with satisfied recoveries.

Keywords Milk; Fumonisins; Hydrolysed metabolites; Solid phase extraction; High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry

（Received 11 July 2011; accepted 28 December 2011）