摘 要 [HTSS]運(yùn)用體積排阻高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SECHPLCICPMS）分析了高鎘積累扇貝和低鎘積累菲律賓蛤仔中鎘的存在形態(tài)，并結(jié)合體外全仿生消化技術(shù)，研究了在唾液、胃、腸無(wú)機(jī)物和有機(jī)物（含消化酶）作用下，扇貝和菲律賓蛤仔中鎘的主要存在形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：扇貝中Cd總量約為菲律賓蛤仔的10倍；在扇貝中檢測(cè)到3種Cd形態(tài)：金屬硫蛋白（MT）Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd和半胱氨酸（Cys）Cd；在菲律賓蛤仔中檢測(cè)到2種Cd形態(tài)：MTCd和GSHCd；以峰面積作參考進(jìn)行比較，扇貝中MTCd和GSHCd含量分別約為菲律賓蛤仔的5.6和2.0倍。結(jié)合體外全仿生模型發(fā)現(xiàn)，在扇貝胃全仿生提取液中，檢測(cè)到1種未知小分子有機(jī)鎘形態(tài)（CdX），在扇貝腸全仿生提取液中檢測(cè)到4種Cd形態(tài)，其中MTCd是主要形態(tài)；而在菲律賓蛤仔胃、腸全仿生提取液中均僅檢測(cè)到1種未知小分子有機(jī)態(tài)鎘（CdX）。本實(shí)驗(yàn)證明貝類中的MTCd， GSHCd， CysCd中絡(luò)合的Cd在生物體胃腸消化液作用下會(huì)發(fā)生解離。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞 [HTSS]鎘； 形態(tài)分析； 體積排阻高效液相色譜； 電感耦合等離子體質(zhì)譜； 體外全仿生消化

[HT][HK]

[FQ（3２，X，DY－Ｗ][CD15] 20110903收稿；20111029接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No.30371103）和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（No.2010t912）資助

 Email: shangdr@ysfri.ac.cn

[HT]

1 引 言

鎘（Cd）是一種有毒重金屬，被美國(guó)毒物管理委員會(huì)（ATSDR）列為第六位危害人體健康的有毒物質(zhì)。Cd在正常環(huán)境中含量很低，但水生生物對(duì)Cd的富集能力極強(qiáng)，如魚(yú)類可富集103～105倍，貝類可富集105～106倍\\[1\\]。因此，Cd已成為影響水產(chǎn)品食用安全的重要因素之一。最近連續(xù)幾年對(duì)我國(guó)貝類進(jìn)行的質(zhì)量安全普查發(fā)現(xiàn)，不同貝類體內(nèi)Cd含量差異很大，尤其以扇貝中Cd含量最高，超標(biāo)現(xiàn)象最為嚴(yán)重。而菲律賓蛤仔中Cd含量很低，前者約為后者的10倍， 甚至更高。Cd在生物體中以多種形態(tài)存在，不同形態(tài)Cd具有不同的生物學(xué)毒性，因此準(zhǔn)確測(cè)定貝類中Cd的主要存在形態(tài)具有重要意義。

色譜與原子光譜、質(zhì)譜聯(lián)用是元素形態(tài)分析的主要技術(shù)手段。如HPLC與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）\\[2，3\\]、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESIMS/MS）\\[4～6\\]、飛行時(shí)間等離子體質(zhì)譜（ICPTOFMS）\\[7\\]等聯(lián)用，分析生物體中Cd的形態(tài)。體積排阻色譜分離（SECHPLC）與ICPMS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)具有交聯(lián)葡聚糖（Sephadex G50）分子篩凝膠過(guò)濾層析的根據(jù)分子量分離化合物的優(yōu)點(diǎn)和ICPMS靈敏的多元素同時(shí)檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)。又因?yàn)槠淞鲃?dòng)相一般采用中性的TrisHCl/NaCl緩沖液，與生物體本身?xiàng)l件相似，因此可以較準(zhǔn)確地反應(yīng)蛋白質(zhì)以及其它巰基化合物在生物體內(nèi)與元素的結(jié)合狀況\\[8，9\\]。Wei等\\[10\\]運(yùn)用SECHPLCICPMS聯(lián)用分析了長(zhǎng)穗偃麥草Agropyron elongatum中的Cu， Zn和Cd的形態(tài)；楊紅霞等\\[11\\]運(yùn)用SECHPLCICPMS聯(lián)用分析了印度芥菜中鎘的形態(tài)，證明Cd以植物螯合肽（PC）3 Cd、植物螯合肽（PC）2 Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd，及半胱胺酸（Cys）Cd 4種形態(tài)存在。

雖然扇貝中Cd超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，但是目前尚無(wú)因食用扇貝而引發(fā)鎘中毒的報(bào)道。因此，研究在生物體的胃腸消化液作用下貝類中Cd的存在形態(tài)，對(duì)評(píng)估貝類中Cd的食用安全性具有積極意義?！叭律狈茨M人體消化環(huán)境，加入消化液所含無(wú)機(jī)物和有機(jī)物（包括消化酶），探討貝類中Cd在人體消化液作用后的主要存在形態(tài)。與動(dòng)物模型相比，體外全仿生消化技術(shù)評(píng)價(jià)貝類中鎘形態(tài)變化更可靠、簡(jiǎn)便、易行。本研究以櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）為研究對(duì)象，采用SECHPLCICPMS聯(lián)用技術(shù)對(duì)扇貝和菲律賓蛤仔內(nèi)Cd的主要存在形態(tài)進(jìn)行分析，并運(yùn)用體外全仿生消化模型，研究在胃腸全仿生消化液作用下2種貝類中Cd的主要存在形態(tài)以及形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ELANDRC Ⅱ電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS，PerkinElmer公司），工作參數(shù)為：射頻功率 1150 W，等離子體氣流速 15 L/min，輔助氣流速1.2 L/min；采樣時(shí)間1800 s。Series 200 高效液相色譜（HPLC，PerkinElmer公司），分離條件：TSKGEL G3000分離柱及TSKGELTMPWgruard Column保護(hù)柱，流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣量80

SymbolmA@ L，自動(dòng)進(jìn)樣。通過(guò)Chromera軟件控制的觸發(fā)接口電纜，以達(dá)到自動(dòng)控制HPLC泵、自動(dòng)進(jìn)樣器與ICPMS聯(lián)用，儀器自動(dòng)積分，以峰面積計(jì)算含量；AA600石墨爐原子吸收儀（PerkinElmer公司）； SHY2A 型水浴恒溫振蕩器（江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器公司）；S40K型pH計(jì)（梅特勒托利多儀器公司）；LNK872型多功能快速消化器（江蘇省宜興市科教儀器研究所）。超純水系統(tǒng)（MilliQ element A10， Millipore）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制參照文獻(xiàn)\\[11\\]：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下配制CysCd及GSHCd標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于確定色譜峰保留時(shí)間。流動(dòng)相配制：10 mmol/L TrisHCl緩沖液，其中加入0.1 mol/L NaCl和0.03% NaN3，調(diào)節(jié)pH=7.5，0.45

SymbolmA@ m濾膜過(guò)濾，超聲40 min除去溶解氧。

2.2 樣品處理

分別稱取約2.5 g扇貝和菲律賓蛤仔樣品，加入兩倍體積經(jīng)4 ℃預(yù)冷的10 mmol/L pH 7.5的TrisHCl緩沖液勻漿，4 ℃靜置過(guò)夜，取勻漿液于4 ℃，以10000 r/min離心20 min，取上清液，0.45

SymbolmA@ m濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。

2.3 胃和腸全仿生消化液制備

參考文獻(xiàn)\\[12，13\\]，制備胃和腸全仿生消化液。分別加入胃和腸中所含的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，調(diào)pH值至各消化液對(duì)應(yīng)的pH值，分別加入相應(yīng)消化酶，制備胃和腸全仿生消化液。具體配制方法見(jiàn)文獻(xiàn)\\[13\\]。

 分 析 化 學(xué)第40卷

第5期趙艷芳等： 體積排阻高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定海產(chǎn)貝類中鎘的形態(tài) 

2.4 扇貝和菲律賓蛤仔全仿生提取液制備

將扇貝、菲律賓蛤仔用超純水沖洗至少3遍后，蒸熟，去殼后勻漿；稱取約5.0 g樣品，加入全仿生唾液10 mL，在37 ℃下恒溫振蕩5 min；加胃液150 mL，在37 ℃下恒溫振蕩2 h；從胃仿生消化食糜中取100 mL，于4 ℃以8000 r/min離心10 min，取上清液用0.45

SymbolmA@ m濾膜抽濾，得胃全仿生提取液。在余下的胃仿生消化食糜中加十二指腸液200 mL和膽汁80 mL，在37 ℃下恒溫振蕩7 h；取腸仿生消化食糜100 mL，于4 ℃以8000 r/min離心10 min，取上清液用0.45

SymbolmA@ m濾膜抽濾，得腸全仿生提取液。胃和腸的全仿生提取液于4 ℃下保存待用。

2.5 扇貝和菲律賓蛤仔中總Cd含量檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品于100 mL消化管中，分別加入15 mL HNO3和5.5 mL HClO4浸泡12 h，用多功能快速消化器消化， 同時(shí)做試劑空白對(duì)照，總Cd采用石墨爐原子吸收測(cè)定。3 結(jié)果與討論

3.1 扇貝和菲律賓蛤仔中總Cd含量

實(shí)驗(yàn)測(cè)得扇貝中總Cd含量為4.87 mg/kg，菲律賓蛤仔中總Cd含量為0.48 mg/kg，前者約為后者的10倍。已有研究表明，扇貝具有高耐受、高積累Cd的特性\\[14，15\\]。但是，目前未見(jiàn)因食用扇貝而導(dǎo)致Cd中毒的報(bào)道。因此，僅檢測(cè)分析貝類中Cd的總量并不能準(zhǔn)確對(duì)貝類中Cd的食用安全性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

3.2 扇貝和菲律賓蛤仔中Cd形態(tài)分析

[TS（][HT5”SS] 圖1 Cd形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

Fig．1 Chromatograms of Cd standard solutions[HT][TS）]

在扇貝組織中主要檢測(cè)到3個(gè)未知峰，出峰時(shí)間分別為7.6，10.5和13.5 min。根據(jù)半胱氨酸（Cys）Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間（圖1）及文獻(xiàn)\\[11，16\\]報(bào)道的分子量范圍，初步判斷13.5 min處為半胱氨酸（Cys）Cd，10.5 min為谷胱甘肽（GSH）Cd，7.6 min為金屬硫蛋白（MT）Cd。因此，扇貝中的Cd主要以MTCd，GSHCd和CysCd 3種形態(tài)存在（圖2a）。在菲律賓蛤仔中主要檢測(cè)到2種Cd形態(tài)峰，[TS（][HT5”SS] 圖2 扇貝（a）和菲律賓蛤仔（b）中鎘形態(tài)分離色譜圖

Fig．2 Chromatograms of Cd species in Chlamys ferreri （C. farreri） （a） and Ruditapes. Philippinarum （R. philippinarum） （b） by SECHPLCICPMS[HT][TS）]分別為MTCd和GSHCd（圖2b）。

由于目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)Cd標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量，只能以峰面積比較2種貝類中有機(jī)Cd的含量分析，2種貝類中主要Cd形態(tài)的含量見(jiàn)表1。由此可見(jiàn)，兩種貝類組織內(nèi)Cd的存在形態(tài)具有一定差異。結(jié)合樣品的質(zhì)量，計(jì)算出扇貝中MTCd的含量約為菲律賓蛤仔的5.6倍，扇貝中GSHCd的含量

[HT5”SS][*4]表1 扇貝和菲律賓蛤仔中主要Cd形態(tài)含量（以峰面積比較）

Table 1 The main Cd species in C. farreri and R. philippinarum （according to the peak area）

[HT6SS][BG（][BHDFG2，WK10，WK6\\.3W]MTCd

GSHCdCysCd扇貝 C. farreri65449

5130140958

菲律賓蛤仔

R. philippinarum1336128280[BHDFG２，WKZQ0W] MT: Metallothionein; GSH: Glutathione; Cys: Cystein.[BG）W][HT][]

約為菲律賓蛤仔的2.0倍。 

已有研究表明，Cd在海洋雙殼貝類體內(nèi)主要以MTCd的形式存在\\[17\\]。本研究通過(guò)形態(tài)分析證明， Cd在貝類組織中以MTCd，GSHCd和CysCd等主要形態(tài)存在。MT是廣泛存在于動(dòng)物各類組織、器官中的功能性結(jié)合蛋白，在機(jī)體微量元素代謝平衡、重金屬解毒、清除自由基等方面具有重要作用\\[1\\]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，廣泛存在于生物體中，具有非常重要的整合解毒作用\\[19\\]。MT和GSH通過(guò)半胱氨酸上的巰基，能與金屬離子（M2＋）結(jié)合，形成無(wú)毒或低毒的配合物而排出體外，從而起到解毒的作用。因此Cd在扇貝和菲律賓蛤仔中均主要以與MT， GSH和Cys的絡(luò)合態(tài)存在，降低了Cd對(duì)生物體的危害。

3.3 全仿生消化作用下扇貝和菲律賓蛤仔中Cd形態(tài)分析

運(yùn)用體外全仿生消化模型，分析在生物體胃和腸消化液作用下，扇貝和菲律賓蛤仔中Cd的主要存在形態(tài)及不同形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，可以為準(zhǔn)確評(píng)估扇貝和菲律賓蛤仔的食用安全性提供重要依據(jù)。

從圖3a可見(jiàn)，在扇貝胃全仿生提取液中檢測(cè)到1種未知峰，出峰時(shí)間為18.5 min，為小分子有機(jī)鎘，定為CdX。圖3b是在腸全仿生消化液作用后，扇貝中Cd的主要存在形態(tài)，共檢測(cè)到4種有機(jī)態(tài)鎘峰，其中主要是MTCd，根據(jù)保留時(shí)間可以判定其余3種均是小分子有機(jī)鎘。但對(duì)于菲律賓蛤仔，在胃和腸全仿生消化液作用下，Cd的主要形態(tài)均為小分子有機(jī)鎘（CdX）（圖4）。

[TS（][HT5”SS] 圖3 扇貝胃全仿生提取液（a）和腸全仿生提取液（b）中鎘形態(tài)分離色譜圖

Fig．3 Chromatograms of Cd species in wholebionic digestion of gastric extracts （a） and wholebionic digestion of intestine extracts （b） for C. farreri by SECHPLCICPMS[HT][TS）]

[TS（][HT5”SS] 圖4 菲律賓蛤仔胃全仿生提取液（a）和腸全仿生提取液（b）中鎘形態(tài)分離色譜圖

Fig．4 Chromatograms of Cd species in wholebionic digestion of gastric extracts （a） and wholebionic digestion of intestine extracts （b） for R. philippinarum by using SECHPLCICPMS[HT][TS）]

在胃全仿生提取液中，兩種貝類的主要Cd形態(tài)相似，且菲律賓蛤仔中小分子有機(jī)鎘（CdX）的濃度高于扇貝（以峰面積做參考）。但是，在腸消化液作用下，扇貝和菲律賓蛤仔中Cd的主要形態(tài)存在很大差異。扇貝腸全仿生提取液中發(fā)現(xiàn)3種小分子有機(jī)鎘，MTCd是腸消化液中的主要存在形態(tài)，可以推斷在唾液、胃、腸中無(wú)機(jī)及有機(jī)物（包括消化酶）作用下，扇貝中的GSHCd，CysCd中絡(luò)合的Cd發(fā)生解離，Cd與未知的分子量很小的有機(jī)物結(jié)合。菲律賓蛤仔全仿生消化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 胃和腸消化液中的Cd均為分子量很小的有機(jī)鎘（CdX），說(shuō)明MTCd中的Cd在胃腸消化液作用下發(fā)生解離。通過(guò)全仿生消化實(shí)驗(yàn)可以得出， 貝類中MTCd， GSHCd和CysCd中絡(luò)合的Cd在胃腸消化液作用下會(huì)發(fā)生解離；同時(shí)證明，未知小分子有機(jī)鎘（CdX）是消化液中主要的Cd形態(tài)之一，而目前關(guān)于小分子有機(jī)鎘（CdX）研究還很少，有關(guān)其結(jié)構(gòu)、形態(tài)及其代謝動(dòng)力學(xué)特性需要進(jìn)一步研究。

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Speciation Analysis of Cadmium in Marine Bivalves by

Size Exclusion ChromatographyHigh Performance

Liquid ChromatographyInductively Coupled

Plasma Mass Spectrometry



ZHAO YanFang， SHANG DeRong*， NING JinSong， ZHAI YuXiu



（Yellow Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences，

The National Center for Quality Supervision and Test of Aquatic products，

Key Laboratory of Test and Evaluation on Quality and Safety of Aquatic Products，

Ministry of Agriculture， Qingdao 266071， China）





Abstract The speciation analysis of cadmium in the scallop （Chlamys farreri， C. farreri） with high Cd accumulation capability and the clam （Ruditapes philippinarum， R. philippinarum） with low Cd accumulation capability was first conducted by size exclusion chromatographyhigh performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry （SECHPLCICPMS）， and in vitro wholebionic digestion model was used to determine the cadmium speciation in two bivalves under the action of saliva， the acidity of stomach and intestine with inorganic and organic components and digestion enzymes. The results showed that the total cadmium content in C. farreri was almost 10 times in R. philippinarum. Three Cd species， metallothionein （MT）Cd， glutathione （GSH）Cd and cystein（Cys）Cd were detected in C. farreri， and two Cd species， MTCd and GSHCd were detected in R. philippinarum. According to the different peak areas， MTCd and GSHCd content in C. farreri was about 5.6 and 2.0 times of those in R. philippinarum respectively. Using in vitro wholebionic digestion model， one unknown Cd species with small molecule （named CdX） was detected in wholebionic digestion of gastric extracts， and four Cd species （mainly MTCd） were detected in the wholebionic digestion of intestine extracts for C. farreri; however， for R. philippinarum， the unknown CdX was the main Cd species in both gastric and intestinal extracts. The experiment also proves that Cd can be separated from MTCd， GSHCd and CysCd under the effect of the wholebionic digestion of stomach and intestine.

Keywords Cadmium; Speciation analysis; Size exclusion chromatographyhigh performance liquid chromatography; Iinductively coupled plasma mass spectrometry; In vitro wholebionic digestion

（Received 3 September 2011; accepted 29 October 2011）



天瑞儀器成功推出三款質(zhì)譜儀新品

近日，由天瑞儀器自主研發(fā)的三款質(zhì)譜儀新品（GCMS 6800氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、ICPMS 2000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、LCMS 1000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀）已完成技術(shù)攻關(guān)、整機(jī)優(yōu)化、性能參數(shù)考核、穩(wěn)定性測(cè)試、專家評(píng)審、媒體發(fā)布等工作，市場(chǎng)推廣正式展開(kāi)。

三款質(zhì)譜儀新品的多項(xiàng)軟硬件設(shè)備均填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。ICPMS 2000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀屬于無(wú)機(jī)質(zhì)譜，作為國(guó)內(nèi)首臺(tái)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，具有高靈敏度，寬動(dòng)態(tài)范圍，多元素檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。儀器采用了離子離軸透鏡系統(tǒng)，六極桿聚焦系統(tǒng)，27.12MHz固態(tài)發(fā)生器，2.0MHz四極桿射頻電源，氣體流量集成控制模塊等創(chuàng)新技術(shù)。

GCMS 6800氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和LCMS 1000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀屬于有機(jī)質(zhì)譜，分別針對(duì)揮發(fā)性強(qiáng)，熱穩(wěn)定性差和不易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性強(qiáng)的中小分子物質(zhì)。GCMS 6800融入了帶電子壓力控制（EPC）、電子流量控制（EFC）的氣相色譜、雙燈絲EI源、帶預(yù)四極桿質(zhì)量分析器、帶高能轉(zhuǎn)換打拿極的電子倍增器等創(chuàng)新技術(shù)。LCMS 1000離子源設(shè)計(jì)采用獨(dú)特的氣路方式，并融入自主研發(fā)的六極桿電源，四極桿電源，離子源加熱模塊，信號(hào)采集與處理，控制電路，多路高壓直流電源等，有效改善低質(zhì)量數(shù)元素檢出限。

據(jù)悉，質(zhì)譜分析技術(shù)是當(dāng)代最高端的分析技術(shù)之一，在食品、環(huán)境、人類健康、藥物、國(guó)家安全等領(lǐng)域具有重要作用。但日漸繁榮的國(guó)內(nèi)質(zhì)譜儀市場(chǎng)，卻長(zhǎng)期主要依賴進(jìn)口。目前國(guó)內(nèi)質(zhì)譜儀器市場(chǎng)幾乎完全為國(guó)外產(chǎn)品壟斷。天瑞儀器歷時(shí)5年的潛心研發(fā)，推出三款質(zhì)譜儀系列新品，對(duì)國(guó)產(chǎn)儀器在高端分析檢測(cè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新突破，具有重要意義。