李 慧 張新文 余 巍 馬艷玲 趙蘭華 王 俊 楊 磊 李映波

流感病毒引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病傳播迅速，可反復(fù)感染。預(yù)防流感大流行暴發(fā)的最有效手段是接種流感疫苗［1］。在流感疫苗中使用佐劑能夠增強(qiáng)其免疫原性，減少單劑流感疫苗的用量，對(duì)于開發(fā)能夠預(yù)防潛在的大流行流感的疫苗均具有現(xiàn)實(shí)意義［2］。

我國(guó)在天然植物藥開發(fā)方面具備傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)。曼地亞紅豆杉(Taxusmadia)原產(chǎn)于美國(guó)、加拿大，是一種天然雜交品種，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)可以用作提取“紫杉醇”的紅豆杉之一，我國(guó)自20世紀(jì)90年代引進(jìn)人工繁殖成功，現(xiàn)在四川、廣西、山東和云南等地已廣泛栽培。

納米乳劑是一種自發(fā)形成的、熱力學(xué)穩(wěn)定、外觀透明或近似透明的體系，具有粒徑小且均勻，易于制備，穩(wěn)定性、流動(dòng)性均較好，易于注射等優(yōu)點(diǎn)，可作為藥物載體應(yīng)用于多種吸收方式的藥物制劑中，是一種較為常見的疫苗佐劑候選［3］。本文在實(shí)驗(yàn)室前期篩選工作的基礎(chǔ)上選取紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物進(jìn)行滅活H3N2流感疫苗的佐劑效果研究并進(jìn)一步測(cè)定了紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物的半數(shù)致死量(LD50)，為其用藥的安全性研究提供一定參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康ICR小鼠，體重18～22g，由本所動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于常溫動(dòng)物房中適應(yīng)飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用水為自來(lái)水。

2.主要試劑和儀器:紅豆杉提取物(曼地亞紅豆杉的枝條和樹皮，經(jīng)鑒定為Taxusmadia。)由本實(shí)驗(yàn)室制備，納米乳由本實(shí)驗(yàn)室制備，H3N2流感病毒滅活疫苗(血凝素含量為43.67μg/ml)由本實(shí)驗(yàn)室制備，氫氧化鋁佐劑(濃度為16.31mg/ml)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備，受體破壞酶(RDE)購(gòu)自日本SEIKEN公司，聚氧乙烯蓖麻油(EL)購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司，1，2－丙二醇購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠，Span 80購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)世界開發(fā)中心，肉豆蔻酸異丙酯(IPM)購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司。電子分析天平產(chǎn)自德國(guó)Sartorius公司，臺(tái)式微型離心機(jī)產(chǎn)自美國(guó)Beckman公司，電熱恒溫水浴鍋產(chǎn)自上海醫(yī)療器械七廠，96孔血凝板產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司，電熱干燥箱產(chǎn)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，磁力攪拌器為德國(guó)IKA C－MAG HS系列。

3.實(shí)驗(yàn)方法:(1)紅豆杉提取物的制備:取紅豆杉枝條置烘箱中，60℃干燥，粉碎，為紅豆杉干燥粉末。將制備所得粉末與蒸餾水混合，每10g粉末與150ml蒸餾水混合，浸泡過夜后，加熱回流10h，放置至室溫，過濾后干燥濃縮后即可。(2)納米乳包裹紅豆杉提取物的制備:按EL∶Span80∶丙二醇∶IPM= 1∶1∶2∶2的配方于攪拌瓶中配制納米乳試劑，將計(jì)算好劑量的紅豆杉提取物(每只小鼠的紅豆杉提取物注射劑量為0.2mg)溶于納米乳劑，室溫下攪拌至溶液為透明，得到以由納米乳劑包裹的紅豆杉提取物混合溶液(其質(zhì)量比為紅豆杉提取物∶EL∶Span80∶丙二醇∶IPM∶水=7∶1000∶1000∶2000∶2000∶1000)。(3)佐劑效果檢測(cè):①含佐劑疫苗的配制及對(duì)照組設(shè)立:本實(shí)驗(yàn)中每只小鼠注射劑量要求:每只小鼠注射0.2m l，含血凝素1.2μg，紅豆杉提取物0.2mg。按所需劑量將紅豆杉提取物溶于疫苗，配制出以紅豆杉提取物為佐劑的流感疫苗。同時(shí)參照納米乳包裹紅豆杉提取物制備方法配制出以納米乳劑包裹的紅豆杉為佐劑的流感疫苗。本實(shí)驗(yàn)設(shè)立的對(duì)照組為:鋁佐劑對(duì)照組，其中Al(OH)3含量為0.2毫克/只，血凝素含量為1.2微克/只;疫苗對(duì)照組，血凝素含量為1.2微克/只;空白對(duì)照組，生理鹽水0.2毫升/只;②免疫小鼠并檢測(cè)效價(jià):將標(biāo)準(zhǔn)體重ICR雌性小鼠隨機(jī)分為5組，每組7只，分別肌內(nèi)注射進(jìn)行初次免疫(表1)。3周后，進(jìn)行第2次肌內(nèi)注射免疫。初免后每隔7天采集小鼠尾動(dòng)脈血，分離血清，檢測(cè)血凝抑制(HI)抗體效價(jià)［4］。連續(xù)監(jiān)測(cè)6周，并分別在1、21和70天時(shí)稱取小鼠體重，觀測(cè)佐劑對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響。重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(4)佐劑的LD50測(cè)試:①預(yù)實(shí)驗(yàn):找出0(Dn)和100%(Dm)估計(jì)致死劑量。根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分組，每組5只。禁食24h，不禁水。24h后開始進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。配制系列濃度的藥液，對(duì)小鼠進(jìn)行一次性腹腔注射，連續(xù)觀察7天，每天觀察4次，記錄動(dòng)物的死亡情況。以小鼠呼吸、心跳停止為L(zhǎng)D50的觀察指標(biāo)。重復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定紅豆杉提取物Dm、Dn分別為500和188.5mg/ kg，納米乳包裹紅豆杉提取物Dm、Dn分別為9.5和5.6g/kg;②正式實(shí)驗(yàn):根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，按1∶0.8分別計(jì)算紅豆杉提取物實(shí)驗(yàn)和納米乳包裹紅豆杉提取物實(shí)驗(yàn)中各組給藥劑量(表3、表4)。各組動(dòng)物禁食24h后按照各組給藥劑量一次性腹腔注射給藥，給藥后飼喂全價(jià)日糧，密切觀察7天并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SASV9.1，SPSS V13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物對(duì)H3N2流感疫苗的佐劑效果:各組HI抗體效價(jià)見表1。由表1和圖1觀察到，免疫后，紅豆杉佐劑組的抗體效價(jià)一直高于疫苗組3～12倍，納米乳包裹紅豆杉佐劑組的抗體效價(jià)一直高于疫苗組4～16倍。14和21天的抗體效價(jià)均高于鋁佐劑組，表明二者的免疫增強(qiáng)作用先于鋁佐劑產(chǎn)生。這可能是因?yàn)殇X佐劑可以降低某些抗原的反應(yīng)原性從而推遲了早期抗體的產(chǎn)生;而納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒恰好是巨噬細(xì)胞(MΦ)和樹突狀細(xì)胞(DC)的首選吞噬目標(biāo)，在誘導(dǎo)疫苗體液免疫應(yīng)答的早期優(yōu)于 Al (OH)3佐劑，能夠快速地激活和提高被免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平［5］。在28天時(shí)，納米乳包裹紅豆杉提取物佐劑組與鋁佐劑組達(dá)到相同的抗體效價(jià)水平，而之后的下降幅度較鋁佐劑組緩和，在35天仍高于鋁佐劑組(圖2)。同時(shí)，由始至終納米乳包裹紅豆杉佐劑組的效價(jià)一直高于單純紅豆杉佐劑組。這可能是因?yàn)榧{米乳可以增強(qiáng)了紅豆杉的免疫活性，促進(jìn)了Th1型和Th2型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫和體液免疫的發(fā)生，而鋁佐劑只能夠激發(fā)Th2型的體液免疫。同時(shí)，納米乳粒徑小，表面積大，包裹紅豆杉后提高了紅豆杉的生物利用度，減少了紅豆杉的使用劑量，并延緩了紅豆杉的釋放，延長(zhǎng)了藥物刺激抗體產(chǎn)生的時(shí)間使機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效的免疫力。

表1 免疫后各組小鼠平均血清抗體效價(jià)

2.佐劑對(duì)小鼠體重變化的影響:根據(jù)表2計(jì)算出各時(shí)間段小鼠體重增加的平均值，使用SPSS V 12.0進(jìn)行方差分析以確認(rèn)紅豆杉佐劑的疫苗和納米乳包裹紅豆杉佐劑的疫苗對(duì)小鼠機(jī)體的刺激性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，差異顯著性水平P=0.992，表明5組小鼠體重增長(zhǎng)并無(wú)顯著差異。證明以紅豆杉為佐劑的疫苗和以納米乳包裹紅豆杉為佐劑的疫苗對(duì)小鼠機(jī)體刺激性較小，對(duì)其生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響。

表2 各組小鼠不同時(shí)間平均體重(g)

3.兩種佐劑的LD50測(cè)試結(jié)果:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3和表4。以SAS v12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析得到紅豆杉提取物的LD50為295.43285mg/kg，95%可信區(qū)間為257.07704～336.95574mg/kg，并得到以死亡概率單位為應(yīng)變量，以對(duì)數(shù)劑量為自變量建立的直線回歸方程為: Y=－15.6625+6.3399X，對(duì)該方程的擬合優(yōu)度Chi－square檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.795，說(shuō)明擬合度良好。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，紅豆杉提取物屬于中等毒級(jí)物質(zhì)［6］。納米乳包裹紅豆杉提取物的 LD50為7.32512g/kg，95%可信范圍為6.90906～7.74439g/kg，并得到以死亡概率單位為應(yīng)變量，以對(duì)數(shù)劑量為自變量建立的直線回歸方程為:Y=－16.8027+ 19.4292X，對(duì)該方程的擬合優(yōu)度Chi－square檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P=0.393，說(shuō)明曲線的擬合度良好。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，納米乳包裹紅豆杉提取物屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)物質(zhì)［6］。納米乳的減毒作用可能同其特性有關(guān)，一方面，納米乳粒徑小，紅豆杉富集于乳滴內(nèi)后增大了與機(jī)體接觸的表面積，增強(qiáng)了佐劑活性，減少了紅豆杉的劑量，并提高了抗原的靶向投遞，降低了紅豆杉的毒性不良反應(yīng);另一方面，納米乳的貯存抗原的作用延緩了紅豆杉的釋放，這樣可能使同一時(shí)間釋放的毒物不足以對(duì)機(jī)體有害或者減緩的毒物釋放過程中機(jī)體產(chǎn)生了抗毒機(jī)制。

表3 紅豆杉提取物L(fēng)D50實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 納米乳包裹紅豆杉提取物的LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討論

流感是世界公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)之一，流感傳染性強(qiáng)、流行快、變異迅速，能夠引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥并導(dǎo)致較高的病死率，已對(duì)世界公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前防止流感最有效的手段就是接種流感疫苗，但是當(dāng)流感大規(guī)模暴發(fā)時(shí)，傳統(tǒng)的流感疫苗研發(fā)和生產(chǎn)的方法無(wú)法滿足在短時(shí)間內(nèi)提供足夠多的疫苗免疫易感人群。因此，研發(fā)能夠預(yù)防和及時(shí)應(yīng)對(duì)大流行流感的疫苗對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生具有十分重要的意義［7］。

佐劑是一種抗原輔助劑，與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果［8］。若輔以較好的佐劑，即可在增強(qiáng)流感疫苗免疫效果的同時(shí)，減少每劑流感疫苗的使用量，讓更多的易感人群能夠接種疫苗，達(dá)到迅速應(yīng)對(duì)大流行暴發(fā)的目的。

我國(guó)在中草藥研究方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。充分發(fā)揮我國(guó)在中草藥方面的優(yōu)勢(shì)，從天然中草藥中篩選出流感病毒疫苗佐劑具有較強(qiáng)的可行性及重要性?，F(xiàn)有的研究成果表明很多中草藥對(duì)人體的特異性免疫和非特異性免疫均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，其中多種中草藥提取物具有較好的佐劑效果［9～12］。

納米乳劑作為疫苗佐劑的研究也是近年來(lái)的一個(gè)熱點(diǎn)。大量的研究證明，納米乳佐劑對(duì)于主藥(包括多種天然藥物)成分具有良好的增溶作用，并能促進(jìn)其吸收，提高生物利用度以及減少過敏反應(yīng)等。Paul等關(guān)于納米乳在乙肝疫苗臨床中應(yīng)用的報(bào)道和Anna等關(guān)于納米乳是艾滋病毒疫苗黏膜給藥的有效佐劑的研究，都表明納米乳能有效增強(qiáng)Th1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫［13，14］;Hamouda等［15］研究證實(shí)納米乳劑可以有效提高血凝素抗原的流感免疫原性。

本研究首次選取了具有抗癌效果的紅豆杉和納米乳包裹的紅豆杉進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)二者對(duì)流感疫苗的佐劑效果。結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)中的紅豆杉提取物和納米乳包裹紅豆杉提取物均具有良好的佐劑效果，有效地提高了HI抗體效價(jià)，可以減少抗原用量并增強(qiáng)免疫效果，而納米乳包裹的紅豆杉可以增強(qiáng)紅豆杉的佐劑活性，更大程度提高了抗原等的靶向投遞，其產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)作用整體優(yōu)于鋁佐劑。LD50的檢測(cè)數(shù)據(jù)表明二者作為佐劑應(yīng)用于小鼠，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀況沒有明顯的影響，可以作為安全有效的新型疫苗佐劑候選，并為相關(guān)的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了毒性依據(jù)，同時(shí)也明確表明了納米乳可以有效的降低紅豆杉的不良反應(yīng)。關(guān)于紅豆杉的免疫增強(qiáng)機(jī)制和對(duì)不同疫苗的佐劑效果以及納米乳的免疫增強(qiáng)機(jī)制和減毒機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，而中草藥和納米乳結(jié)合作為聯(lián)合佐劑是一個(gè)嶄新而有前景的研究方向。

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