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        薺菜多糖提取液的除蛋白工藝研究

        2012-04-01 01:57:46黃榕彬賀冬秀陳臨溪唐國濤
        化工技術(shù)與開發(fā) 2012年11期

        歐 文,黃榕彬,曹 軒,賀冬秀,陳臨溪,唐國濤

        (南華大學(xué)藥物藥理研究所,湖南 衡陽 421001)

        薺菜(Capsella bursa-pastoris)為十字花科1~2年生草木植物,全草可入藥,是藥食同源植物。薺菜多糖是薺菜中的主要活性成分之一。近年來,多糖所具有的各種生理功能逐漸為人們所重視,如降低血糖濃度、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等。從天然動植物提取的多糖,往往含有大量蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)的存在不僅可能影響其結(jié)構(gòu)和生物活性,且可能導(dǎo)致藥理作用下降[1~2],因此,脫蛋白是一個重要的環(huán)節(jié)。常見的脫蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法等[3],不同的除蛋白方法適用于不同來源的多糖,目前尚未見到去除薺菜多糖中蛋白質(zhì)方法的研究報道。本試驗通過對以上3種方法的比較,對薺菜多糖提取液中最佳的蛋白質(zhì)去除方法進(jìn)行了初步探討,以清潔、條件溫和、操作簡單的方法為多糖類藥品和保健產(chǎn)品的開發(fā)提供了有利條件[4].。

        1 材料與儀器

        薺菜采摘于湖南省衡陽市新華開發(fā)區(qū),經(jīng)過南華大學(xué)嚴(yán)奉祥教授鑒定。薺菜陰干,粉碎,過0.42mm篩,備用。

        日本島津UV-2450紫外分析儀、BSZZ4S型電子分析天平、80-1型離心機(jī)。

        木瓜蛋白酶、考馬斯藍(lán)G-250(Roche)、牛血清白蛋白。葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、濃硫酸等均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 多糖提取方法

        稱取薺菜藥材粉末60g,加4倍量95%乙醇回流提取脫脂,藥渣加600mL蒸餾水超聲1h,過濾,離心,取上清液,得粗多糖提取液。

        2.2 多糖含量測定方法

        采用苯酚-硫酸法,準(zhǔn)確稱取葡萄糖20.0mg,置燒杯中,加水溶解轉(zhuǎn)至100mL容量瓶并稀釋至刻度作為母液,吸取 0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL葡萄糖母液置不同的具塞試管中用蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL,加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL,搖勻冷卻,室溫放置20min,490nm測吸光度,以2.0mL蒸餾水按同樣操作為空白對照,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X,吸光度為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)行回歸處理,建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.183X-0.003(r=0.9994)。表明葡萄糖質(zhì)量濃度在1.0~6.0mg·mL-1的范圍內(nèi),X與Y的線性關(guān)系良好。

        2.3 蛋白含量測定方法

        蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[5]。取6支具 塞 試 管,分 別 加 入 0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL配置好的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液(100g·L-1),用蒸餾水加至0.6mL,搖勻后各加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL(100mg考馬斯亮藍(lán)G-250與50mL 95%的乙醇混合,再加入100mL 85%的磷酸溶液定容至1000mL),放置5min,在595nm波長下測定。以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)X,吸光度為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)行回歸處理,建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=1.2457X+0.1020(r=0.996)。表明牛血清白蛋白含量在16.7~100mg·mL-1的范圍內(nèi),X與Y的線性關(guān)系良好。

        2. 4 蛋白去除方法比較研究

        2. 4. 1 指標(biāo)的確定

        采用蛋白去除率和多糖損失率作為指標(biāo)進(jìn)行考察。

        2.4.2 Sevag法

        取50mL多糖提取液,按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的體積比為16∶4∶1加入氯仿與正丁醇,混合物離心振蕩30min,分出上清液,多次重復(fù)上述步驟測定上清液的多 糖和蛋白濃度。多次測量蛋白去除率均不足80%(圖1),而此時多糖的損失率在20%。

        圖1 Sevag法

        2.4.3 三氯乙酸法

        依次取10mL多糖提取液加入5支具塞試管,再分別加入1mL,2mL,3mL,4mL,5mL三氯乙酸溶液(3 mol·L-1),4℃下靜置過夜,離心棄去沉淀,收集上清液,測定多糖和蛋白濃度。測定蛋白去除率85.52 %(圖2),多糖損失率為25.08 %。

        2.4.4 木瓜蛋白酶法

        配置木瓜蛋白酶溶液:取1g木瓜蛋白酶,用pH 5.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解,定容至100mL,酶液最終質(zhì)量濃度為10g·L-1。另取10 mL多糖提取液,加入2.0%的木瓜蛋白酶溶液,在50℃水浴酶解1.5h,沸水浴滅酶10min,冷卻至室溫,3000r·min-1離心5min除去沉淀,取上清液醇沉,沉淀復(fù)溶至原體積,測定溶液中多糖和蛋白濃度。測定蛋白去除率88.21%,多糖損失率為7.43%。

        圖2 三氯乙酸法

        比較Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法脫除蛋白的效果,發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶法除蛋白的去除率最高,多糖損失率最小,因此選擇木瓜蛋白酶法除蛋白進(jìn)行優(yōu)化實驗,考察不同因素對蛋白去除率的影響。

        2.5 蛋白去除率的影響因素優(yōu)化

        2.5.1 酶用量對蛋白去除率的影響

        取10mL薺菜多糖提取液,在反應(yīng)溫度60℃,pH 5.0的反應(yīng)體系中,分別加入酶用量為1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%的木瓜蛋白酶溶液,水解2h,測定酶用量對蛋白去除率的影響。當(dāng)酶用量2.0%時,蛋白去除率為89.01%(圖3),繼續(xù)增加酶用量,蛋白去除效果增加不明顯,故酶用量選擇2.0%。

        圖3 酶用量對蛋白去除率影響

        2.5.2 pH對蛋白去除率的影響

        溫度60℃,酶用量2.0%,調(diào)節(jié)pH分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,酶解 2h 后,測定蛋白的去除率(圖4),當(dāng)pH為5.0時,蛋白去除率最高。

        2.5.3 酶解時間對蛋白去除率的影響

        在溫度60℃,酶用量2.0%,pH 5.0時,分別測定酶解時間為 0.5h,1.0h,1.5h,2.0h,3.0h,4.0h 的蛋白去除率,蛋白去除率在一定范圍內(nèi)隨酶解時間的延長而增加,1.5h后,蛋白去除率趨向平穩(wěn)(圖5)。因此,選用1.5h作為最佳酶解時間。

        圖4 p H對蛋白去除效果的影響

        圖5 酶解時間對蛋白去除率的影響

        2.5.4 溫度對蛋白去除率的影響

        當(dāng)酶用量2.0 %,pH 5.0,酶解反應(yīng)時間1.5 h時,分別測定酶解溫度為40℃,50℃,60℃,70℃,80℃時蛋白去除率,酶的活力在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增高,溫度超過60℃后,酶活力下降(圖6)。因此,反應(yīng)的最適溫度應(yīng)為60℃ 。

        圖6 酶解溫度對蛋白去除率的影響

        在兼顧蛋白去除率和多糖損失率的情況下,在考察單因素的基礎(chǔ)上對酶法設(shè)計正交實驗來優(yōu)化除蛋白的工藝。

        2.5.5 酶法除蛋白工藝優(yōu)選

        在單因素考察的基礎(chǔ)上,選取酶用量(A)、pH(B)、溫度(C)、酶解時間(D)為考察因素,每個因素考察3個水平,進(jìn)行正交實驗,以蛋白去除率優(yōu)選木瓜蛋白酶法除蛋白的工藝,因素和水平見表1。

        表1 酶法除蛋白工藝因素水平Table1 Factors and levels of removing protein by enzyme method

        由直觀分析結(jié)果可以看出4個因素對蛋白質(zhì)去除率的影響程度不同,依次為A>D>C>B,故以B作誤差項進(jìn)行方差估算,結(jié)果見表3。A因素和D因素對蛋白去除率都有顯著性影響,C因素?zé)o顯著性影響。最佳條件為A2B1C2D3,即酶用量2.0%,pH 5.0,溫度60℃,時間2.0h,在該條件下蛋白的去除率為91.12%。

        表2 酶法除蛋白工藝L9正交試驗及結(jié)果Table 2 Results of L9(3)4 orthogonal test of removing protein by enzyme method

        表3 蛋白去除率方差分析Table 3 Analysis of variance of PRP

        2.5.6 工藝驗證

        按酶法除蛋白的最佳工藝對同一批多糖提取液進(jìn)行驗證(n=3) ,蛋白去除率分別為89.56%、90.15%、91.23%,多糖損失率分別為5.25%、5.69%、6.03%。3次結(jié)果均處于較高水平, 說明該提取工藝是可靠的。

        3 討論

        Sevag法需要多次重復(fù)操作,多糖損失量大,成本高;三氯乙酸法多糖損失率較高可能是含有氨基易形成復(fù)鹽降低其溶解度,并且以上方法都引入了大量有機(jī)試劑,易造成有機(jī)殘留,不宜大規(guī)模應(yīng)用。木瓜蛋白酶法效率高,條件溫和,蛋白去除率和多糖保留率都很高,不引入有機(jī)試劑,因而能夠較好應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,能為多糖類藥品和保健產(chǎn)品的開發(fā)提供有利條件。

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