許來俊，王成章，嚴(yán)學(xué)兵，張森浩，李 佳

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

苜蓿(Medicagosativa)是目前世界上栽培歷史最悠久、分布最廣泛的多年生豆科牧草。因其具有營養(yǎng)豐富、適口性好、蛋白質(zhì)含量高和易于消化等特點，確立了其作為優(yōu)質(zhì)草畜飼料獨一無二的地位，并享有“牧草之王”的美譽(yù)，長期以來在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[1]。

隨著西部退耕還林還草戰(zhàn)略的實施，在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的前提下，篩選并選育抗鹽堿、抗旱、抗寒、耐貧瘠的苜蓿品種已成為主要目標(biāo)。就育種而言，除了傳統(tǒng)的育種手段，利用基因工程技術(shù)來培育新品種已成為一種重要手段，而苜蓿組織培養(yǎng)可以說是利用基因工程技術(shù)進(jìn)行基因改良和新品種選育的基礎(chǔ)，只有建立了穩(wěn)定、高頻的再生體系，才能構(gòu)建較好的轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率，獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而獲得改良新品種。因此，利用各種再生體系建立體細(xì)胞無性變異系或利用基因工程技術(shù)對其產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等方面進(jìn)行改良，將為牧草生產(chǎn)做出重要貢獻(xiàn)。70年代初，國外就從苜蓿的愈傷組織成功誘導(dǎo)出了植株。Saunders和Bingham[2]通過器官形成和體胚愈傷組織發(fā)育兩條途徑，最終成功分化出完整的苜蓿植株，標(biāo)志著苜蓿再生體系研究的開始。1981年，上海植物生理生態(tài)研究所楊燮榮等[3]在國內(nèi)首次利用紫花苜蓿葉片、葉柄、莖段成功誘導(dǎo)出了愈傷組織，并獲得了再生植株。至此，國內(nèi)關(guān)于紫花苜蓿再生體系的研究拉開了帷幕。經(jīng)過30年的研究，苜蓿植株再生體系的建立已取得了較大的進(jìn)展，現(xiàn)將其基本技術(shù)的研究進(jìn)展及所遇到的問題進(jìn)行簡單綜述。

1 苜蓿的植株再生途徑

1.1直接分化芽再生途徑 直接分化芽再生途徑是指外植體細(xì)胞不經(jīng)過脫分化階段形成愈傷組織，而直接分化出不定芽進(jìn)而獲得再生植株。該途徑轉(zhuǎn)化頻率較低，易產(chǎn)生嵌合體，但再生周期短、遺傳變異小，尤其是莖尖分生組織細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性非常好。目前以植物的幼莖、胚軸、葉片、莖尖和子葉為外植體，直接分化再生體系的建立已有很多成功的例子[4]。1988年McCabe等[5]用基因槍轉(zhuǎn)化大豆(Glycinemax)莖尖成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。苜蓿葉片、花莖、花序、莖段等外植體可在添加適當(dāng)BA和NAA的MS培養(yǎng)基上直接成苗，成苗率達(dá)30%～70%[6]。

1.2愈傷組織再生途徑 愈傷組織再生途徑是指外植體先經(jīng)過脫分化培養(yǎng)形成愈傷組織，然后經(jīng)過再分化形成再生植株。該途徑是苜蓿組織培養(yǎng)及快繁的主要方式，具有以下特點：1)外植體取材范圍廣，苜蓿的多種器官及組織均能實現(xiàn)再生。很多研究發(fā)現(xiàn)，采用不同的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及再分化，均能得到再生植株，但再生頻率有很大差別，這與基因型及外植體種類、培養(yǎng)基的成分等的不同有關(guān)[7]。2)擴(kuò)繁量大，轉(zhuǎn)化率高。3)嵌合體多，且隨著組織培養(yǎng)繼代延長，嵌合體比例增加。4)遺傳變異大，不穩(wěn)定。因此，對于優(yōu)良苜蓿品種采用愈傷組織再生途徑快繁時，應(yīng)該注意對再生植株進(jìn)行遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)方面的鑒定，以保持種子的遺傳穩(wěn)定性。

1.3原生質(zhì)體再生途徑 植物的原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁后的“裸露”細(xì)胞，具有細(xì)胞的全能性。原生質(zhì)體再生途徑即通過分離原生質(zhì)體，進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，由此再分化出再生植株，它是改變植物遺傳品質(zhì)的主要方法和手段[8]。 用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的材料一般為再生性強(qiáng)的器官或組織，或具再生潛力的懸浮細(xì)胞系和胚性愈傷組織。

1980年Kao和Michayluk[9]利用苜蓿的葉肉分離原生質(zhì)體并誘導(dǎo)形成再生苗，苜蓿同一品種不同單株分離出的原生質(zhì)體在胚狀體形成及分裂頻率上有差異。1994年白靜仁等[10]利用15～20日齡的野生黃花苜蓿(M.polymorpha)葉肉原生質(zhì)體成功獲得了再生植株。Santos等[11]利用30～35日齡的苜蓿幼苗的葉片來分離原生質(zhì)體并形成再生植株，但是當(dāng)苗齡超過35日齡時，由葉片分離的原生質(zhì)體則不能分裂。黃紹興等[12]利用保定苜蓿(M.sativacv.Baoding)的根的原生質(zhì)體成功獲得再生植株。劉明志[13]利用大葉紫花苜蓿下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織原生質(zhì)體形成小愈傷組織，進(jìn)一步形成體細(xì)胞胚并最終發(fā)育成完整植株。Gilmour等[14-15]將M.sativa的原生質(zhì)體分別和M.quasifalcata、M.falcata、M.borealis等的原生質(zhì)體融合，并獲得愈傷組織。

1.4胚狀體途徑 在組織培養(yǎng)的離體條件下，任何體細(xì)胞均可誘導(dǎo)植物胚胎的發(fā)生。在功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)被稱為胚狀體或體細(xì)胞胚，它在一定的培養(yǎng)條件下可以發(fā)育成完整的植物體。胚狀體的誘導(dǎo)和發(fā)育是植物細(xì)胞具有全能性的最可信的證明，由此而建立的再生體系也是最為理想的基因遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)[16]。其優(yōu)點是嵌合體較少、轉(zhuǎn)化率高、遺傳性一致。

李聰?shù)萚17]對22個苜蓿品種的子葉進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，魚雷狀胚誘導(dǎo)成苗率最高可達(dá)74%。李望豐等[18]通過添加不同濃度的2,4-D對12個苜蓿品種的根的誘導(dǎo)的研究，篩選出來體胚發(fā)生能力和分化率均較高且對2,4-D敏感的品種，進(jìn)一步完善了胚狀體再生體系。王強(qiáng)龍等[19]研究得出最佳的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基為SH培養(yǎng)基，并建立了紫花苜蓿體細(xì)胞胚的高頻再生體系。

2 苜蓿再生體系的研究

2.1品種基因型的選擇 品種基因型是影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因素，相同物種的不同基因型之間體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力存在很大差異[20]。Sairam等[21]的研究表明，苜蓿的再生能力受基因型控制且高度遺傳，可以通過輪回選擇法來提高植株的再生能力。Cerasela等[22]利用羅馬尼亞的3個苜蓿品種Topaz、Coral、Super來研究不同類型的外植體產(chǎn)生愈傷組織的能力,初步研究表明苜蓿的組織培養(yǎng)對基因型有很強(qiáng)的依賴性。Chen等[23]對3個不同栽培品系的50個不同基因型苜蓿的由愈傷培養(yǎng)形成體細(xì)胞胚和再生植株的能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明苜蓿的基因型與其再生能力是密切相關(guān)的，具有較高再生能力的基因型形成體細(xì)胞胚能力對培養(yǎng)基及外植體的來源依賴性低，而其他基因型的品種則只能用特定的外植體或者在合適的培養(yǎng)基上才能分化形成體細(xì)胞胚。Monteiro等[24]在研究5個不同品種的苜蓿原生質(zhì)體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，雖然當(dāng)子葉或葉片作為外植體時都能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但只有品種Rangelander的葉片可以分化出體細(xì)胞胚，并獲得再生植株。李聰?shù)萚17]曾對22個國內(nèi)外不同基因型的紫花苜蓿做了再生試驗，并在國內(nèi)首次研究了不同基因型對苜蓿體細(xì)胞胚形成的影響。試驗表明，不同基因型品種在分化苗的能力上存在著很大的差異。徐春波等[25]用4個紫花苜蓿品種中苜 1號、公農(nóng)1號、獵人河和WL-323獲得高頻再生體系，研究了基因型對紫花苜蓿脫分化和再分化的影響。結(jié)果表明，WL-323的愈傷組織分化率最高達(dá)到76.3%,為最佳基因型。

2.2外植體的選擇 外植體是由活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。近些年來，國內(nèi)外研究報道中所采用的外植體種類繁多，幾乎苜蓿所有組織或器官都可以作為外植體，如幼芽、下胚軸、子葉、莖尖、花粉、莖段、上胚軸、葉片、葉柄、根、花藥等。研究者發(fā)現(xiàn)，對于同一植物不同部位的組織細(xì)胞來說，其脫分化和再分化的能力會因其生理狀態(tài)或植株年齡不同而呈現(xiàn)出差異，因此選擇合適的外植體也是決定苜蓿組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。

一些試驗結(jié)果表明葉柄是最佳的外植體。Navak和Konecna[26]對不同植株部位原始材料的培養(yǎng)特性研究表明，葉柄的體細(xì)胞胚形成能力和再生能力最強(qiáng)。Gallego等[27]利用葉柄、下胚軸、子葉和葉片作外植體，試驗結(jié)果也認(rèn)為葉柄是最好的外植體，平均產(chǎn)生18個體細(xì)胞胚，且有8%的體細(xì)胞胚可形成再生植株。

另一些學(xué)者[28-31]的研究則表明下胚軸是紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。王強(qiáng)龍等[19]在試驗中發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿同一品種內(nèi)不同外植體間的愈傷組織誘導(dǎo)率差異很明顯，其誘導(dǎo)率排序為下胚軸>葉柄>子葉>葉片，而Scarpa等[32]在對一年生黃花苜蓿的胚性愈傷組織誘導(dǎo)中同樣發(fā)現(xiàn)下胚軸>根>葉柄和子葉節(jié)>葉片。王涌鑫等[33]在對保定苜蓿的再生體系的研究中發(fā)現(xiàn)下胚軸比子葉具有更短的愈傷組織誘導(dǎo)時間、更高的誘導(dǎo)率和更高的胚狀體分化率，并認(rèn)為它是苜蓿組織培養(yǎng)首選的外植體。

張靜妮等[34]對3個紫花苜蓿品種(秘魯、關(guān)中、甘農(nóng)3號)及2個雜花苜蓿(M.varia)品種(甘農(nóng)1號、甘農(nóng)2號)的不同外植體的愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行研究，得出在葉柄、子葉節(jié)、子葉、葉片這4種外植體中，子葉節(jié)是誘導(dǎo)愈傷的最佳外植體材料。鄭寶仁等[35]的研究選用子葉節(jié)為外植體，建立了從種子萌發(fā)到馴化移栽僅需8周的苜蓿子葉節(jié)離體培養(yǎng)體系。

趙金梅等[36]以真葉為外植體，在 MS+0.2 mg ·L-12，4- D+0.01 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1KT 培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率可達(dá)100%，愈傷組織誘導(dǎo)繼代2～3次，然后在MS培養(yǎng)基上分化，分化率可達(dá)90%，將形成的苗轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根，形成完整的再生苗。

羅馬尼亞學(xué)者Cerasela 等[22]分別利用葉片、根、葉柄作為外植體來誘導(dǎo)愈傷，結(jié)果表明，根是愈傷誘導(dǎo)的最佳外植體。Iantcheva等[37]利用雜花苜蓿品種R108的根作外植體，根先用1 mol·L-1蔗糖溶液預(yù)處理48和72 h，然后在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果表明，預(yù)處理72 h的根完成再生所用時間最短(55 d)，體胚形成再生植株的比例最大(70%)。

張明娟和王曉萍[38]的研究得出幼葉有利于誘導(dǎo)愈傷組織，而帶有腋芽的莖段有利于誘導(dǎo)再生芽，可根據(jù)不同的目的選擇不同的組織部位作為外植體來進(jìn)行培養(yǎng)。Ziauddin等[39]用苜蓿品種RSY27的莖尖作為外植體，在添加1 μmol·L-1IBA的MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，得到了再生植株。陳愛萍等[40]以小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的苜蓿花藥為材料，研究培養(yǎng)方法、花藥接種密度以及谷氨酰胺對苜?；ㄋ幱鷤M織誘導(dǎo)的影響，來提高苜?；ㄋ幍呐囵B(yǎng)效率。

從前人的研究可以看出，對于不同的基因型和不同的試驗?zāi)康膩碚f，最適合的外植體是不同的，應(yīng)針對具體情況來篩選合適的培養(yǎng)基。

2.3基本培養(yǎng)基的選擇 在很大程度上，培養(yǎng)基成分制約著離體培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生和組織生長。雖然植物組織培養(yǎng)對營養(yǎng)物質(zhì)的基本需要類似于完整植株，但實際上在實驗室條件下不同物種之間組織培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)成分變化很大[41]，所以應(yīng)根據(jù)實際情況來選擇合適的培養(yǎng)基。國內(nèi)外文獻(xiàn)中報道的對苜蓿愈傷組織和胚狀體進(jìn)行誘導(dǎo)的不同組合培養(yǎng)基有多種。

Shao等[42]對比了2種簡單、快速、有效的苜蓿轉(zhuǎn)化再生體系。第1個再生體系采用的是MSH系統(tǒng)，即葉片先在含2,4-D和KT的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后繼代到不含生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上。第2個再生體系采用的是Bh5系統(tǒng)。兩個系統(tǒng)誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚都轉(zhuǎn)移到Boi2Y培養(yǎng)基(Blaydes培養(yǎng)基+100 mg·L-1肌醇+2 g·L-1酵母提取物)上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚分化。Boi2Y培養(yǎng)基的使用對縮短再生時間和提高體胚成苗率、胚分化成苗率非常重要。結(jié)果表明，MSH系統(tǒng)上10～14周可得到轉(zhuǎn)化植株，而B5h系統(tǒng)則需要12～16周。王強(qiáng)龍等[19]的研究卻表明，在MS、MSO、Boi2Y和SH 分別作為苜蓿體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，除了Boi2Y培養(yǎng)基不能形成體細(xì)胞胚，其余3種培養(yǎng)基均能成功形成體細(xì)胞胚，而SH培養(yǎng)基的體胚的分化率明顯高于其他培養(yǎng)基。Cheyne和Dale[43]以莖尖分生組織為材料利用B5培養(yǎng)基成功分化出再生植株。舒文華等[44]專門對B5培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基作了比較，結(jié)果表明，采用B5培養(yǎng)基的大量元素配合MS培養(yǎng)基的其他成分有利于苜蓿胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，同時也利于分化出苗。

很多研究表明，MS培養(yǎng)基是苜蓿培養(yǎng)的適合培養(yǎng)基。張靜妮等[34]以秘魯、關(guān)中、甘農(nóng)3號3份紫花苜蓿品種及甘農(nóng)1號、2號2份雜花苜蓿品種為試驗材料，來研究WPM、MS、N6、SH、B5這5種不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，且培養(yǎng)基中分別添加2，4-D 2.0 mg·L-1和蔗糖30 g·L-1。結(jié)果表明，MS是紫花、雜花苜蓿品種的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。Kenichi 和Tadashi[45]研究了31個苜蓿品種的體細(xì)胞胚發(fā)生能力，發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基上有14個品種具有體胚發(fā)生能力，而在SH培養(yǎng)基上只有3個品種具有體胚發(fā)生能力。宮相忠和黃健[46]的研究結(jié)果表明MS培養(yǎng)基有利于苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)，而SH培養(yǎng)基則更適合于愈傷組織的分化。時永杰和周麗霞[47]將供試的幾種豆科牧草在MS、N6、B5等培養(yǎng)基上均誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織，其中以MS培養(yǎng)基上形成的愈傷組織質(zhì)量最好、數(shù)量最多、增殖最迅速。

2.4植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展方向在很大程度上是由基本培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度以及不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之間的比例配置等所決定的。苜蓿組織培養(yǎng)中常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有2類，即生長素類和細(xì)胞分裂素類。生長素和細(xì)胞分裂素在培養(yǎng)基中的比值大小對組織培養(yǎng)體系的形態(tài)發(fā)生十分重要，它決定了外植體發(fā)育或分化的方向[6]。

2,4-D已經(jīng)在很多試驗中被用作牧草類植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時的生長素[48-49]。一般情況下，生長素(2,4-D的質(zhì)量濃度在1～3 mg·L-1)對于誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織是必需的[50]。Saunders和Bingham[2]的研究表明，紫花苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)需要高濃度的2,4-D,而體細(xì)胞胚的形成階段則必須降低2,4-D濃度或者不使用2,4-D，否則胚性愈傷會在生長素的持續(xù)作用下進(jìn)入脫分化狀態(tài)，不斷產(chǎn)生愈傷組織，最終不能形成成熟的體細(xì)胞胚或再生植株。馬伶俐[4]的研究中將2,4-D質(zhì)量濃度設(shè)置為1、2、3、4 mg·L-14個梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，愈傷組織的褐化數(shù)量也呈增加趨勢，說明高濃度2,4-D會引起胚性愈傷組織的褐化，且濃度越高褐化越嚴(yán)重。李聰?shù)萚17]研究認(rèn)為在 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織的形成時，2，4-D是不可缺少的，且適宜的添加水平為2 mg·L-1，而生長素與細(xì)胞分裂素配合使用比單獨使用生長素誘導(dǎo)效果要好。

越來越多的試驗結(jié)果顯示，低濃度的細(xì)胞分裂素，能夠幫助提高愈傷組織的誘導(dǎo)率[48,51-52]。常用的細(xì)胞分裂素為KT和6-BA。王涌鑫[53]的研究表明，在愈傷誘導(dǎo)階段，2,4-D起到了主要作用，KT能輔助2,4-D發(fā)揮更好的效果，但是在胚狀體誘導(dǎo)階段，KT可以單獨發(fā)揮很好的作用，2,4-D就不再被需要了。在研究不同濃度KT對胚狀體誘導(dǎo)和成熟的影響時，0.2 mg·L-1KT質(zhì)量濃度對胚狀體的誘導(dǎo)和成熟是最適濃度，高質(zhì)量濃度的KT(0.4、0.6 mg·L-1)會顯著降低胚狀體誘導(dǎo)率。Walker等[54]研究外源激素對促進(jìn)幼苗和幼根分化的影響時發(fā)現(xiàn)，在高濃度2,4-D、低濃度激動素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基上后能產(chǎn)生大量無菌苗。李望豐等[18]的研究表明，SH中添加2,4-D 50 μmol·L-1和KT 5 μmol·L-1可產(chǎn)生具有高度再生能力的胚性愈傷組織，不加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)則有利于再生。梁慧敏等[55]試驗指出誘導(dǎo)中苜1號葉片外植體愈傷組織需較高濃度的2,4-D，BA的效果優(yōu)于KT和ZT，最佳的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良SH+4.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA。Bai和Qu[56]在對草坪型酥油草(Festucaovina)的研究中也發(fā)現(xiàn)6-BA能明顯提高愈傷組織的再生能力。但是馬伶俐[4]在研究不同2,4-D、6-BA濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響中卻發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度越高形成正常狀態(tài)的愈傷組織越少，6-BA濃度越低則形成正常狀態(tài)的愈傷組織越多，即兩者成反比。并認(rèn)為6-BA的存在抑制誘導(dǎo)愈傷，在誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織形成的過程中不宜加入6-BA。

2.5其他添加物的應(yīng)用 國內(nèi)外的研究人員認(rèn)為，在體胚形成過程中加入脯氨酸、AgNO3等對苜蓿體胚形成有一定的作用。Stuart[57-58]研究了苜蓿組織培養(yǎng)過程中氨基酸的作用，認(rèn)為加入氨基酸對苜蓿體胚形成有一定的影響。在SH培養(yǎng)基中加入50～300 mmol·L-1的脯氨酸比不加脯氨酸的對照組體胚生成率高出3倍。Hammad等[59]將愈傷組織轉(zhuǎn)入30 mmo l·L-1脯氨酸和10 mmo l·L-1NH4NO3的SH再生培養(yǎng)基上，3周后體胚大量產(chǎn)生。Romagnoli[60]試驗中，MS培養(yǎng)基中附加10～20 mmol·L-1NH4和30 mmol·L-1脯氨酸能形成大量體胚。1987年，Meijer和Brown[61]研究表明，在體胚誘導(dǎo)和分化過程中銨是必不可少的,誘導(dǎo)時最適濃度為5 mmol·L-1，而分化時則宜采用10～20 mmol·L-1的濃度,并認(rèn)為外源氨基酸對分化不是必需的，甚至常常是起阻遏作用的，除了1或2 g·L-1的水解酪蛋白或者4.4 mmol·L-1谷氨酰胺+3.1 mmol·L-1脯氨酸可以增加體胚數(shù)(20%～30%)外。但是Neves等[62]發(fā)現(xiàn)添加脯氨酸會增加苜蓿體胚的死亡率。梁慧敏等[63]的試驗認(rèn)為脯氨酸濃度較低時對分化沒有影響，但當(dāng)質(zhì)量濃度超過50 mg·L-1時分化率明顯下降。王強(qiáng)龍等[19]的研究表明，L-脯氨酸對隴東、大葉、甘農(nóng)1號3個品種的體胚誘導(dǎo)和分化基本沒有影響。從前人的研究可以看出，可能因品種、培養(yǎng)基、試驗條件等方面的差異，脯氨酸對體胚的影響沒有統(tǒng)一的結(jié)論。

組織培養(yǎng)是在密封的容器中進(jìn)行的，植物細(xì)胞會產(chǎn)生乙烯，而積累的乙烯對植物器官發(fā)生和體細(xì)胞胚的形成均有抑制作用，甚至?xí)?dǎo)致植株的畸形生長和發(fā)育。張鵬等[64]研究表明在培養(yǎng)基中添加AgNO3可消除這種情況，認(rèn)為Ag+可能是通過競爭性結(jié)合于細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白而抑制乙烯的活性，從而來提高植株再生頻率。徐春波等[25]在對品種WL-323的高頻再生體系研究中發(fā)現(xiàn)，最佳繼代培養(yǎng)基為MSO+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1AgNO3，添加適量AgNO3明顯促進(jìn)了愈傷質(zhì)量的改善，胚性愈傷率明顯升高。李培英等[65]以MSO為基本培養(yǎng)基，添加2.00 mg·L-1AgNO3使新疆大葉苜蓿的分化率從41.1%增加到63.3%。低濃度的AgNO3可以促進(jìn)新疆大葉苜蓿的分化，而高濃度下其分化率降低，這可能是高濃度的Ag+破壞植物體內(nèi)離子平衡，出現(xiàn)離子毒害所致。

蔗糖濃度也對胚狀體的誘導(dǎo)和植株的再生有著顯著影響[66-67]。Meijer 和Brown[61]認(rèn)為過低或過高的蔗糖濃度都會降低體胚的發(fā)生率，3%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較適宜，但是王強(qiáng)龍等[19]的試驗表明蔗糖質(zhì)量濃度為20 g·L-1時，胚狀體的誘導(dǎo)率達(dá)到最高(78%)。王涌鑫[53]的試驗認(rèn)為高濃度的蔗糖有助于愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)和成熟，但是對于生根是不利的，在愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)、成熟階段，培養(yǎng)基中添加30 g·L-1的蔗糖，而在生根階段，1/2 MS培養(yǎng)基內(nèi)添加15 g·L-1的蔗糖比較合適。

翟桂玉等[68]對幾種復(fù)合添加物質(zhì)(如水解酪蛋白、酵母提取物、胨、椰乳、馬鈴薯勻漿汁)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)這幾種復(fù)合添加物對體細(xì)胞胚的發(fā)生均有明顯促進(jìn)作用，其中以胨的效果最好，酵母提取物次之。此外梁慧敏等[63]和馬海燕等[69]均發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽(GSH)作為一種含硫化合物，可降低愈傷組織的褐化程度，在15 mg·L-1時可顯著促進(jìn)胚狀體的分化。

3 其他方面的研究

除了品種、培養(yǎng)基等方面的影響，一些學(xué)者還研究了光照對苜蓿再生的影響。時永杰和周麗霞[47]試驗表明在暗培養(yǎng)的條件下雖然也能產(chǎn)生愈傷組織，但是愈傷數(shù)量少，質(zhì)量差，分化率低。毛雅妮等[70]研究光照對苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及體胚發(fā)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光暗交替條件下誘導(dǎo)的愈傷組織體細(xì)胞胚發(fā)生率高于暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織體細(xì)胞胚發(fā)生率。李聰?shù)萚17]在對22個苜蓿品種再生體系研究過程中采用3 000 lx的連續(xù)光照也取得試驗成功。所以關(guān)于光照的控制，應(yīng)根據(jù)組織培養(yǎng)的整個體系的情況來綜合考慮。

在微觀方面，宮相忠和黃健[46]在顯微鏡下的觀察表明，體細(xì)胞胚起源于單個的胚性細(xì)胞，它既能在愈傷表面發(fā)生，又可在其內(nèi)部發(fā)生。體細(xì)胞胚經(jīng)過球形期、心形期、魚雷期及子葉期各階段可形成再生植株。王友生等[71]的研究卻發(fā)現(xiàn)在同一塊愈傷組織上往往同時存在各個時期的胚狀體(球形期、心形期、魚雷期、子葉期)，這說明胚狀體的產(chǎn)生在時間上有一定的差異。

4 苜蓿再生過程中存在的問題及發(fā)展前景

綜合苜蓿植株再生體系的研究現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)存在的問題主要集中在以下幾個方面：

1)再生體系不穩(wěn)定，可重復(fù)性較差。很多試驗由于試驗條件、藥品質(zhì)量、人為因素等原因在重復(fù)后無法得到相同的試驗結(jié)果，即使是針對同一品種，不同的研究人員得出的結(jié)果也不完全相同。

2)再生周期長，體胚分化率低。從前人的研究情況來看，大部分的再生過程都需要3～5個月。在再生體系的各個條件都較適合的情況下，應(yīng)對外植體的生長狀況密切觀察，在最適宜的時間轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，在最有利于外植體分化出苗的同時盡量縮短再生周期。

3)受基因型影響大。大量研究表明，對于不同品種或同一品種的個體基因型來說，在相同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基的條件下，其愈傷誘導(dǎo)率一般無顯著差異，但是體胚分化率往往差異顯著，而體胚分化率低就大大減少了再生植株的獲得及以后的通過基因轉(zhuǎn)化成功改良苜蓿性狀的可能性。已有很多學(xué)者指出紫花苜蓿的基因型是限制其再生能力的最大因子[72]。因此，需要擴(kuò)大試驗范圍，進(jìn)一步摸索適宜的再生條件，篩選出再生效率高且穩(wěn)定的材料。

4)關(guān)于再生機(jī)理的討論很少。只有清楚機(jī)理，才能找到解決問題的關(guān)鍵點。但目前大部分的工作依舊處在表面探索階段，未對再生機(jī)理作深入研究。今后可在體細(xì)胞胚的形成以及體胚分化過程中生長素、細(xì)胞分裂素等內(nèi)源激素的含量變化及信號傳導(dǎo)等方面進(jìn)行研究。

隨著苜蓿植株再生體系更深入、更廣泛的研究，建立再生效率高且穩(wěn)定的再生體系，將使人們能夠更好地通過生物技術(shù)手段來進(jìn)行品種培育和品種改良，同時在苜蓿作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物疫苗、工業(yè)酶制劑和一些重要的藥用蛋白等方面也能夠得到更好的發(fā)展。

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