張文軍 孫利梅 楊洪穎 左燕紅 李茂恒 屈志鋼

胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的多藥耐藥性(multidrugs resistance，MDR)，這是導(dǎo)致胃癌綜合治療效果不佳的重要原因［1，2］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有多種MDR相關(guān)蛋白質(zhì)與胃癌MDR有關(guān)，但這些蛋白質(zhì)都不能全面解釋胃癌MDR現(xiàn)象，尋找新的與胃癌MDR相關(guān)的因子對探討MDR機(jī)制、尋找MDR逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)有重要意義。埃茲(Ezrin)基因是新近發(fā)現(xiàn)的與許多惡性腫瘤關(guān)系密切的新基因，可影響多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，在胃癌中也發(fā)揮重要作用［3－5］。研究顯示，Ezrin蛋白還與腫瘤MDR有關(guān)，但Ezrin蛋白是否與胃癌MDR有關(guān)及其作用的機(jī)制尚未見報(bào)道。故本研究檢測了Ezrin蛋白和與腫瘤MDR關(guān)系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌中的表達(dá)，并對其關(guān)系和意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年10月至2009年10月在我院手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者的石蠟標(biāo)本52例，其中36例有癌旁組織石蠟標(biāo)本。所有患者均為初診手術(shù)，腫瘤均為原發(fā)性胃癌，術(shù)前均未接受任何治療。其中男38例，女14例;年齡29～75歲，平均年齡(57±10)歲。兔抗人Ezrin、LRP多克隆抗體、鼠抗人P-gp、GST-π單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)公司。

1.2 免疫組化染色(SP 法)測定 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP 蛋白表達(dá) 石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片后進(jìn)行HE和免疫組化染色。切片脫蠟水化，3%過氧化氫孵育、蒸餾水沖洗，以PBS浸泡后進(jìn)行抗原修復(fù)。以下嚴(yán)格按試劑盒說明操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 染色結(jié)果由兩位病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片判斷結(jié)果。每張切片隨機(jī)取5個高倍視野(×400)，每視野均計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的陽性率。Ezrin、P-gp、GST-π、LRP主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為染色陽性。記分標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞內(nèi)無陽性表達(dá)為(－)，＜50%細(xì)胞陽性表達(dá)為(+)，≥50%細(xì)胞陽性表達(dá)為(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各因子間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和癌旁組織中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表達(dá)情況52例胃癌組織中 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP陽性表達(dá)率分別為77.8%、62.2%、73.3%、71.1%;癌旁組織 4 種蛋白表達(dá)陽性率分別為 26.7%、77.8%、35.6%、37.8%。經(jīng)比較，Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌組織中的表達(dá)均較癌旁組織增強(qiáng)(P＜0.05)。見表 1、圖 1。

表1 Ezrin、P-gp、GST-π、LRP在胃癌和癌旁組織中的表達(dá) 例

圖1 胃癌組織Ezrin、P-gp、GST-π、LRP的表達(dá)(SP×200)

2.2 胃癌和癌旁組織中Ezrin、P-gp、GST-π、LRP蛋白表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中Ezrin與P-gp表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3385，P=0.0141)，Ezrin與 LRP 表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3072，P=0.0267)，Ezrin 與 GST-π表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.2449，P=0.0801);P-gp與 LRP表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.2986，P=0.0315)，P-gp 與 GST-π、GST-π與LRP之間表達(dá)均無明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.2275，P=0.1048;r=0.1668，P=0.2373)。

3 討論

胃癌是我國病死率最高的惡性腫瘤，該病進(jìn)展快、預(yù)后差，總體5年生存率不超過40%?；熓俏赴┑闹匾委熓侄沃?，但由于胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的多藥耐藥性(MDR)［1，2］，造成化療效果差，腫瘤易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。迄今關(guān)于腫瘤MDR的研究已近40年，發(fā)現(xiàn)了多種與MDR有關(guān)的蛋白質(zhì)，逆轉(zhuǎn)MDR的藥物也已開始應(yīng)用，但一直未能發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。因此，尋找新的影響胃癌MDR的蛋白質(zhì)對探討胃癌MDR機(jī)制、確定MDR逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)有重要意義。Ezrin蛋白在細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮重要作用，并且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、粘附狀態(tài)等功能［6］，在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在過表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2－4］。本結(jié)果顯示，Ezrin蛋白在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，說明Ezrin蛋白表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，與其他報(bào)道結(jié)果符合。近年來還發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白還與腫瘤的 MDR有密切的關(guān)系［5］，抑制 Ezrin蛋白對腫瘤的MDR特性有逆轉(zhuǎn)作用。因此，本研究進(jìn)一步檢測了與胃癌MDR關(guān)系密切的P-gp、GST-π、LRP在胃癌組織中的表達(dá)，并分析了它們與胃癌MDR的關(guān)系。

P-gp是目前研究最多的與MDR相關(guān)的蛋白質(zhì)，它定位于腫瘤細(xì)胞膜上，可以通過“藥泵”作用把化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗［6］。GST-π則可以通過解毒作用把對細(xì)胞有殺傷作用的化療藥物水解為無害物質(zhì)，造成腫瘤化療效果減弱［7］。LRP具有與P-gp類似的作用，該蛋白激活時可以阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核，也可以把進(jìn)入核內(nèi)的藥物泵出核外，并儲存于細(xì)胞質(zhì)的囊泡中，最終通過胞吐作用排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致 MDR［8］。本研究顯示，P-gp、GST-π、LRP 在胃癌組織中的表達(dá)均較癌旁組織增強(qiáng)，說明胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的MDR特性，對化療藥物的敏感性差。分析Ezrin蛋白與P-gp、GST-π、LRP 的結(jié)果顯示，Ezrin 蛋白與 P-gp、LRP 均存在正相關(guān)關(guān)系，說明在胃癌MDR中，Ezrin蛋白可能通過影響P-gp、LRP的表達(dá)而參與胃癌MDR;而Ezrin蛋白與GST-π表達(dá)之間并未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)，說明在導(dǎo)致胃癌MDR的多種機(jī)制中，Ezrin蛋白可能僅與其中部分機(jī)制有關(guān)。這些結(jié)果僅處于現(xiàn)象觀察階段，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究予以闡明。

本研究初步證實(shí)了Ezrin蛋白在胃癌組織中表達(dá)增高，它可能通過影響P-gp、LRP的表達(dá)而參與胃癌MDR。但我們也發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白僅與部分胃癌MDR蛋白有關(guān)，關(guān)于Ezrin蛋白參與胃癌MDR的機(jī)制還不明確，有待于進(jìn)一步深入研究。

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8 Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines.Oncol Rep，2011，26:1081-1089.