王正輝 常會(huì)敏 吳寶俊 楊壯群 KamalMustafa 盧曉云

松質(zhì)骨基質(zhì)復(fù)合生物蛋白膠構(gòu)建組織工程軟骨的研究

王正輝 常會(huì)敏 吳寶俊 楊壯群 KamalMustafa 盧曉云

目的嘗試采用松質(zhì)骨基質(zhì)與生物蛋白膠復(fù)合材料構(gòu)建組織工程軟骨。方法體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞，接種于松質(zhì)骨基質(zhì)/生物蛋白膠材料上行體外培養(yǎng)。采用HE、甲苯胺藍(lán)染色免疫學(xué)檢測、掃描電鏡觀察等方法觀察所構(gòu)建的組織工程軟骨的特性。結(jié)果松質(zhì)骨基質(zhì)/生物蛋白膠組的組織學(xué)結(jié)構(gòu)更接近于軟骨樣組織，其Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因表達(dá)量及蛋白多糖含量明顯高于松質(zhì)骨基質(zhì)組。結(jié)論松質(zhì)骨基質(zhì)/生物蛋白膠復(fù)合材料可用于構(gòu)建組織工程軟骨，是一種較理想的支架材料。

軟骨細(xì)胞組織工程生物蛋白膠支架材料

先天性畸形或后天獲得性疾病導(dǎo)致的軟骨組織缺損，如耳、鼻、氣管的缺損或畸形等，嚴(yán)重影響患者的顏面外觀或器官功能。軟骨是一種無血管的組織，自身修復(fù)能力有限。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程軟骨的構(gòu)建為修復(fù)軟骨缺損開辟了一條新途徑。

在組織工程軟骨的構(gòu)建中，大量生長狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞以及合適支架材料起著十分關(guān)鍵的作用。近年的研究表明，多種生物材料均可用于組織工程軟骨的構(gòu)建，各種材料均有各自的優(yōu)勢和缺點(diǎn)。松質(zhì)骨基質(zhì)（BMG）是具有良好的組織親和性和結(jié)合力的天然生物材料。但是，單純的松質(zhì)骨基質(zhì)對軟骨細(xì)胞的吸附力并不強(qiáng)，軟骨細(xì)胞不易附著，而且松質(zhì)骨基質(zhì)支架的孔隙大小不等，孔徑相對較大，軟骨細(xì)胞易丟失，不易形成軟骨組織。因此，本研究嘗試將BMG與生物蛋白膠復(fù)合，用于構(gòu)建組織工程軟骨。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司）；透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）；胎牛血清（Invitrogen公司）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗大鼠，Neomarker公司）；Aggrecan單克隆抗體（羊抗大鼠，Santa Cruz公司）；殼聚糖/明膠（天津中醫(yī)藥大學(xué)）；BMG（第四軍醫(yī)大學(xué)骨科）；生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司）；Real-time PCR mix(Toyoboco公司)；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；熒光顯微鏡（Nikon公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠肋軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)[1]

SD大鼠頸椎脫臼法處死，無菌操作臺中取其肋軟骨組織，剝離軟骨膜，用眼科剪剪至1mm3左右的組織塊。采用三步法消化，獲得軟骨細(xì)胞，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)采用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（比例為1∶1）進(jìn)行消化，25 cm2培養(yǎng)瓶接種，接種密度為1×105cells/mL。本實(shí)驗(yàn)所采用的是第2代肋軟骨細(xì)胞，分別接種于松質(zhì)骨基質(zhì)/生物蛋白膠材料（BMG/生物蛋白膠組）與松質(zhì)骨基質(zhì)材料（BMG組）上進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2.2 BMG/生物蛋白膠-軟骨細(xì)胞復(fù)合物的構(gòu)建

將松質(zhì)骨基質(zhì)浸泡于DMEM培養(yǎng)液中5 min后取出，用滅菌濾紙吸干附在松質(zhì)骨基質(zhì)表面和網(wǎng)眼內(nèi)的水分，浸泡凝血酶后晾干。將纖維蛋白原主體膠與第1代軟骨細(xì)胞混合，制成1×107cells/mL的細(xì)胞懸液，向材料上滴入纖維蛋白原細(xì)胞懸液50μL，加入DMEM培養(yǎng)液200μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)10min。將軟骨模塊全部移至24孔培養(yǎng)板中，加入2mL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天半量更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)8周。

1.2.3 組織學(xué)觀察

培養(yǎng)1周時(shí)取出組織塊，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作切片，行HE、甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察。

1.2.4 免疫學(xué)檢測[2]

培養(yǎng)6周的組織塊以4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25min，0.01M PBS洗3次，每次5min；滴加1滴3%H2O2，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。0.01M PBS洗滌3次，每次3 min；滴加1滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15min，以消除非特異性染色；分別滴加（1:200）Ⅱ型膠原（CollagenⅡ）單克隆抗體50μL，4℃冰箱過夜（＞18 h）；加入用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標(biāo)記的二抗，培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育15 min；0.01 M PBS洗3次，每次5 min；避光，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 掃描電鏡觀察

培養(yǎng)2、4周的標(biāo)本各1塊，2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脫水，干燥，掃描電鏡觀察支架材料表面軟骨細(xì)胞的黏附和細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

1.2.6 Real-time PCR檢測CollagenⅡ及Agrecan mRNA含量[3]

6周時(shí)用Trizol常規(guī)提取組織塊RNA，CollagenⅡ引物序列:5’-AACACTGCCAACGTCCAGAT-3’/ 3’–CTGCAGCACGGTATAGGTGA-5’；Aggrecan引物序列:5’-GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT-3’/3’–GTGTGGATGGGGTACCTGAC-5’；內(nèi)參GAPDH序列:5’-AAATGGTGAAGGTCGGTGT G-3’/3’–GGTAGTTGCTGGGGAAGT-5’。具體操作根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.7 生物化學(xué)分析

6周時(shí)檢測構(gòu)建的組織工程軟骨的GAG和羥脯氨酸的含量，以分別驗(yàn)證A ggrecan和C ollagenⅡ的含量。采用Hoechst 33258染色法進(jìn)行測量，以硫酸軟骨素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，二亞基亞甲藍(lán)分光比色法檢測GAG。采用L-羥脯氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測羥脯氨酸的含量[4]。所有檢測均重復(fù)3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

構(gòu)建的組織工程軟骨1周時(shí)HE染色顯示，軟骨細(xì)胞位于一個(gè)篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)中，彼此之間被相鄰的細(xì)胞胞外基質(zhì)分開。BMG/生物蛋白膠組較BMG組表現(xiàn)出更好的軟骨樣組織特征。在BMG/生物蛋白膠組細(xì)胞外周和區(qū)間基質(zhì)被甲苯胺藍(lán)染色深藍(lán)色證實(shí)了蛋白多糖的存在，而在BMG組甲苯胺藍(lán)染色呈淡藍(lán)色（圖1）。

2.2 免疫學(xué)和SEM觀察

6周時(shí)，Ⅱ型膠原免疫染色顯示，BMG/生物蛋白膠組中基質(zhì)強(qiáng)染，而BMG組只有較淺的著色。電鏡觀察顯示，在BMG/生物蛋白膠組可觀察到篩網(wǎng)內(nèi)密集的或者單個(gè)的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞周圍有大量的基質(zhì)。而BMG組只能觀察到少量的軟骨細(xì)胞（圖2）。

圖1 BMG/生物蛋白膠組與BMG組組織學(xué)觀察（100×，光鏡）Fig1 The histological observation of tissue in BMG/fibrin glue group and BMG group(100×,lightm icroscope)

2.3 生化分析和Real time PCR檢測

Real time PCR檢測顯示，BMG/生物蛋白膠組和BMG兩組的Ⅱ型膠原基因表達(dá)沒有顯著差異（P＞0.05）；而蛋白多糖的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BMG/生物蛋白膠組明顯高于BMG組（P＜0.05）。BMG/生物蛋白膠復(fù)合體和BMG組中mRNA的表達(dá)證實(shí)這兩種支架材料都具有維持軟骨細(xì)胞表型的能力（圖3）。生化分析結(jié)果顯示，與BMG組相比，BMG/生物蛋白膠組糖胺多糖、羥脯氨酸的水平顯著增加（P＜0.05），BMG組的羥脯氨酸含量只有BMG/生物蛋白膠組的36.5%（圖4）。

圖2 BMG/生物蛋白膠組與BMG組免疫組化染色（100×，熒光顯微鏡）和電鏡觀察（標(biāo)尺：100μm）Fig2 The imm unological observation(100×,fluorescence m icroscope)and SEM observation(Scale:100μm)of tissue in BMG/fibrin glue group and BMG group

圖3 BMG/生物蛋白膠組與BMG組C olⅡ、A ggrecan基因表達(dá)量Fig.3 The expression of collagen II and aggrecan in BMG/fibrin glue group and BMG group

圖4 BMG/生物蛋白膠組與BMG組糖胺多糖和羥脯氨酸含量Fig.4 The glycosam inoglycan and hydroxyproline content in BMG/fibrin glue group and BMG group

3 討論

BMG是骨組織經(jīng)過脫鈣、去脂、去蛋白等處理，去掉了除BMP以外95%非膠原蛋白和有阻滯作用的脂質(zhì)成分，降低了抗原性[5-6]，同時(shí)松質(zhì)骨基質(zhì)還存留有少量BMP和其他促進(jìn)骨軟骨形成的內(nèi)在生長因子。但是，單純的BMG對軟骨細(xì)胞的吸附力并不強(qiáng)，軟骨細(xì)胞不易附著，容易丟失，不易形成軟骨組織。生物蛋白膠又稱為纖維蛋白封閉劑，可塑性強(qiáng)，生物相容性好，是組織工程軟骨構(gòu)建可選擇的聚合物支架[7]。Lynn等[8]已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能在人纖維蛋白凝膠中分裂增殖、合成基質(zhì)并保持其表型。纖維蛋白膠存在降解速度過快的缺點(diǎn)[9]，我們嘗試將BMG/生物蛋白膠進(jìn)行復(fù)合，以期能夠相互彌補(bǔ)缺陷，更為符合組織工程軟骨構(gòu)建的要求。

我們發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞與單純的BMG黏附性較差。軟骨細(xì)胞很容易從BMG支架材料上脫落，從而影響軟骨組織的形成。這種低黏附性可能是由于BMG相對較大的孔徑造成的。目前研究中，解決細(xì)胞低黏附性問題的方法就是用生物蛋白膠制備BMG/生物蛋白膠凝膠支架材料。本研究結(jié)果表明，與單純BMG材料比較，BMG/生物蛋白膠支架材料上的軟骨細(xì)胞能分泌更多特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在軟骨細(xì)胞之間形成大大小小的群集，維持了原代細(xì)胞的形態(tài)。另外，組織學(xué)證明，在BMG/生物蛋白膠上的軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的沉積優(yōu)于BMG組，可能是由于BMG/生物蛋白膠組的細(xì)胞接種率和接種均勻性較單純的BMG組好造成的。將生物蛋白膠復(fù)合后明顯促進(jìn)了高質(zhì)量的軟骨組織的形成[10]。

理想的適合軟骨組織工程的支架材料不僅能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的黏附與增殖，而且能維持軟骨細(xì)胞表型。眾所周知，在體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時(shí)，尤其是在培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中的單層培養(yǎng)系統(tǒng)，軟骨細(xì)胞容易去分化，從而失去分泌軟骨特有細(xì)胞外基質(zhì)大分子（如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖）的能力，取而代之的是分泌Ⅰ型膠原。去分化后的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械性能較差的纖維軟骨[11]。本研究中，透明軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)分子（Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖）基因表達(dá)表明，在BMG/生物蛋白膠及BMG組都很好維持了軟骨細(xì)胞的表型。具有正常表型和功能的軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白的含量很高、蛋白多糖的表達(dá)較高，這表明我們構(gòu)建的軟骨樣組織，其軟骨細(xì)胞表型在培養(yǎng)的前6周得到很好的維持，說明這兩種支架材料都能支持軟骨細(xì)胞的生長和軟骨形成。

盡管BMG/生物蛋白膠和單純BMG組在組織學(xué)上并沒有明顯的差異，兩組的Ⅱ型膠原基因表達(dá)圖譜也沒有明顯差異。但是，兩組的蛋白多糖表達(dá)存在很大的不同。這種自相矛盾的檢測結(jié)果，可能是應(yīng)為mRNA和蛋白質(zhì)分析水平的差異。

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Construction Tissue-Engineered Cartilage Using Bone M atrix Gelatin and Biological Fibrin G lue

WANG Zhenghui1, CHANG Huim in1,WU Baojun1,YANG Zhuangqun2,Kamal Mustafa3,LU Xiaoyun4.
1 Department of Otolaryngology-Head &Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;2 Department of Plastic and Burns Surgery,The First A ffiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China;3 Faculty of Dentistry, University of Bergen,Norwa;4 Departmentof Biological Science and Bioengineering,School of Life Science and Technology, Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China.Corresponding author:WU Baojun(E-mail:yzhqun@mail.xjtu.edu.cn).

Objective To explore the feasibility of the construction of tissue-engineered cartilage using hybrid scaffolds of demineralized bonematrix gelatin(BMG)and fibrin glue.M ethods Rattus chondrocytes were cultured on hybrid BMG/ fibrin glue scaffolds(BMG/fibrin glue group)and BMG scaffolds(BMG group)in vitro.Engineered cartilage-like tissue grown on the scaffolds was characterized by histological observation,immunological examination,scanning electron m icroscopy, biochemical assays and analysis of gene expression.Results The presence of proteoglycan was confirmed by positive toluidine blue in BMG/fibrin glue group,compared with BMG group.Collagen type II exhibited intense immuno-positivity at the peri-cellularmatrices in BMG/fibrin glue group,compared with BMG group.The expression of collagen typeⅡhad no significant difference between BMG/fibrin glue group and BMG group(P＞0.05),while the expression of aggrecan core protein in BMG/fibrin glue group was higher than that in BMG group(P＜0.05).The glycosaminoglycan production and hydroxyproline content of BMG/fibrin glue group were higher than that of BMG group(P＜0.05).Conclusion The fibrin/BMG hybrid scaffoldsmay serve as a potential cell delivery vehicle and a structural basis for cartilage tissue engineering.

Chondrocytes;Tissue-engineered cartilage;B iological fibrin glue;Scaffolds

Q813.1+2

A

1673－0364（2012）03－0126－04

2012年3月20日；

2012年4月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（西安交通大學(xué)國際合作類，交叉學(xué)科類）；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)基金。

710004陜西省西安市西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉-頭頸外科（王正輝，常會(huì)敏，吳寶俊）；710061陜西省西安市西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形燒傷科（楊壯群）；挪威卑爾根大學(xué)牙科學(xué)院（Kamal Mustafa）；710049陜西省西安市西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（盧曉云）。

吳寶俊（E-mail:yzhqun@mail.xjtu.edu.cn）。