劉春 朱曉楠 劉茹鳳 任靜波 石虎 荀立杰 夏慶友

（家蠶基因組生物學國家重點實驗室西南大學生物技術學院，重慶 400716）

家蠶（Bombyx mori）具有吐絲結繭的行為，對正在變態(tài)發(fā)育的蠶蛹進行保護并防御外來侵害[1]。家蠶在馴養(yǎng)進化過程中出現(xiàn)大量的突變品種，其中在記錄的超過400種，性狀分布在家蠶發(fā)育的各個時期。從20世紀初，科學家們便開始利用突變品系對家蠶進行經典遺傳學研究，取得成果頗豐，為家蠶研究打下堅實基礎[2]。

隨著家蠶基因組的破譯，家蠶基因組學迅速發(fā)展，各種分子標記建立高密度分子連鎖圖譜、家蠶多樣性指紋圖譜以及以克隆為基礎的物理圖譜[3]相繼出現(xiàn)。利用分子標記技術可對影響家蠶生長率、產量、繭絲質量以及抗病性的基因進行打靶，遺傳上快速重組遺傳物質建立新的品種，令蠶業(yè)經濟保持可持續(xù)發(fā)展[3]。

近些年，家蠶定位克隆研究發(fā)展迅速，oq油蠶、伴性赤蟻、暗化型、綠繭等突變基因先后被報道定位。各種分子代謝機制也紛紛被解密。

絲腺為家蠶幼蟲體內最大的器官，是合成和分泌絹絲的外分泌腺。蠶絲是由兩根并行單纖維構成。一般繭絲中絲素占70%～80%，絲膠占20%～30%。

蠶繭主要由繭衣、繭層、蛹衣、蛹體和蛻皮構成。對蠶繭性狀的描述，主要有繭形、繭色、全繭量、繭層率等。另外，繭層率因品種、時期、雌雄、化蛹程度、繭型大小、飼育方法環(huán)境等不同而呈現(xiàn)差異。此外，衡量蠶繭的經濟性狀指標還有：繭絲長和繭絲重、解舒絲長和解舒率、出絲率、繭絲纖度等[4]。

家蠶綿繭突變（Flossy，F(xiàn)l，系統(tǒng)編號：02－220），為自然突變品系，因繭層浮松，繭外形寬大且不規(guī)則而得名，由Banno[5]等人于2001年報道。綿繭突變系單基因突變，遵循孟德爾經典遺傳規(guī)律，其經典連鎖位點是第7連鎖群的32.1[1]。綿繭突變是家蠶少數(shù)有關繭絲形成和營繭行為相關的突變之一，對研究繭絲品質形成和家蠶營繭行為有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

夏芳、大造、綿繭品種蠶繭，由西南大學家蠶基因庫提供。2009年春季于西南大學蠶學與生物系統(tǒng)研究所蠶房按常規(guī)方法飼養(yǎng)夏芳、大造、綿繭品種，上蔟采繭后隨機抽樣取繭若干做實驗材料。

1.2 不同發(fā)育時期觀察

綿繭和大造不同時期的形態(tài)觀察比較：對所調查品種的蟻蠶，成蟲、絲腺直接進行肉眼和顯微鏡形態(tài)觀察。

1.3 繭層率的測量

繭層率的測量方法參考（絲綢學院絲綢教研組.繭絲學實驗指導），具體方法如下：隨機抽取各品種蠶繭30粒，10粒一組，剝去繭衣，削繭，去蛹，標記。按常規(guī)方法稱量全繭量、蛹重。將繭放入烘箱內烘至無水恒重（前后稱量差不超過0.001g），稱其無水干量（標準狀態(tài)20℃RH60%～65%下稱重）[6]。計算繭層率：

1.4 含膠率的測量

含膠率的測量方法參考（絲綢學院絲綢教研組.繭絲學實驗指導），具體方法如下：取各品種蠶繭繭層5.00g，在浴比1∶100的中性皂溶液中煮沸進行脫膠，時間約1h，中間更換中性皂溶液一次。后期使用0.83%的碳酸鈉溶液、微醋酸水溶液、單蒸水處理洗滌脫膠后的絲素。用胭脂紅苦味酸法檢驗絲膠是否脫盡。最后于烘箱內將絲素烘至無水恒重（前后稱量差不超過0.001g），稱量[6]。做3次重復。

1.5 繭絲顯微鏡觀察

繭絲顯微鏡觀察的方法參考（絲綢學院絲綢教研組.繭絲學實驗指導），具體方法如下：各取夏芳、大造、Fl蠶繭1粒，將蠶繭分為內層、中層、外層；每層剪取小塊繭絲，置于載玻片上，使用2%NaOH溶液對繭絲進行脫膠處理，然后單蒸水洗凈，做成裝片，進行顯微鏡觀察，放大倍數(shù)為4×10[6]。

1.6 繭絲絲膠蛋白SDS－PAGE

繭絲顯微鏡觀察的方法參考榮海博碩士畢業(yè)論文，具體方法如下：各品種蠶繭，剪碎后，定量為0.10g，使用1×PBS溶解提取絲膠蛋白質，上樣電泳[7]。

2 結果與分析

2.1 綿繭的形態(tài)觀察

2.1.1 不同品種蠶繭形態(tài)觀察

于常規(guī)條件下飼養(yǎng)夏芳、大造、Nd、綿繭蠶品種，將各品種采集的蠶繭分類放置于通風干燥環(huán)境下。蠶繭拍照結果如圖1所示，圖中可見綿繭繭衣與繭層之間界限不明顯，蠶繭表現(xiàn)多層且浮松，形狀不規(guī)則；大造和夏芳品種繭層緊實，大造繭形呈紡錘形，夏芳則呈橢圓形；蠶繭大小上，綿繭體型較大，接近于夏芳。綿繭蛹體型大小接近于大造蛹體。

圖1 家蠶不同品種蠶繭比較

2.1.2 不同蠶品種絲腺觀察比較

我們對在相同條件下飼養(yǎng)的大造、綿繭和夏芳品種，于5齡第三天時隨機抽取三個品種蠶，并解剖取出絲腺進行觀察比較，拍照結果如圖2所示。圖中比較發(fā)現(xiàn)，解剖大造、綿繭和夏芳5齡第三天幼蟲，三者絲腺之間不存在明顯差異，彎折基本一致，夏芳整個絲腺偏大，大造的絲腺偏小，而綿繭的居中。

圖2 大造、綿繭和夏芳5齡第3天絲腺比較

2.2 不同品種蠶繭繭層率和含膠率調查

我們對夏芳、大造、綿繭品種的蠶繭的繭絲性狀進行調查，主要對全繭量、繭層率以及蠶繭含膠率進行了調查，每個品種隨機抽取蠶繭10粒，進行全繭量、繭層量、繭層率調查記錄，共重復三次，結果如表1所示。

調查結果顯示，夏芳、綿繭、大造繭層率分別為：23.476%、15.551%、12.919%，品種間繭層率為下降趨勢；含膠率調查中，三個品種的含膠率分別為：27.182%、29.608%、34.767%，品種間含膠率為上升趨勢。綿繭蛹體重與大造蛹體基本一致。綜合看來，三個品種繭層率和含膠率之間呈現(xiàn)負相關關系，我們將結果整理，如圖3所示。圖中可看出，三個品種間，隨著繭層率的下降，對應含膠率則呈上升趨勢。這里值得注意的是，在綿繭繭層量比大造品種高的情況下，兩個品種的蛹體重基本一致。

表1 不同品種蠶繭繭絲性狀調查

圖3 不同品種蠶繭性狀調查

2.3 繭絲顯微鏡觀察

比較夏芳、大造、綿繭的內中外層繭層，各品種的繭層用2%NaOH溶液脫膠后，顯微鏡拍照如圖4所示。結果顯示，同品種不同繭層之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異；綿繭同其他品種相比，不同品種相同繭層之間沒有明顯差異。由于繭絲脫膠的原因，因而不排除含絲膠的繭絲存在差異。

2.4 不同品種蠶繭絲膠蛋白電泳

為了比較夏芳、大造、綿繭繭層絲膠蛋白的成分差異，將1×PBS提取的絲膠蛋白進行蛋白質電泳，結果如5所示。圖中可以看出，綿繭絲膠蛋白和夏芳、大造相比，成分上沒有明顯差異。圖中可看出，在25KD左右處，各個品種都有一條較為明顯的蛋白帶，該蛋白是絲素蛋白P25或fib－L蛋白或其它蛋白還有待進一步鑒定。

3 討論

綿繭突變體在研究和生產上具有很大應用價值，其不僅具有揭露繭絲形成機理的潛力，而且綿繭更適合被應用于蠶絲被的生產。遺傳上，綿繭屬于單基因突變，遵循經典遺傳定律，表型上，綿繭繭層浮松，多分層。通過對綿繭繭層率、含膠率和絲膠蛋白成分分析，希望能找出其繭層浮松的原因，為繭絲形成機理和綿繭定位克隆研究提供線索。

圖4 不同品種外中內繭層的繭絲比較

圖5 不同品種蠶繭絲膠蛋白電泳

綿繭的形成機制一直是個謎題，綿繭突變體在發(fā)育、體形、生理上與野生型相比均沒有明顯差異，致使繭層浮松和多層的原因一直未知。日本方面也對綿繭突變體幼蟲的吐絲行為進行了觀察研究，同樣未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。本文從繭層率、含膠率和蛋白質水平尋找綿繭與野生型個體的不同，但從繭層率、含膠率和蛋白質電泳結果來看，與正常個體相比，綿繭并未表現(xiàn)出明顯的差異。這也意味著綿繭形成的原因仍是一個未知的謎題。而就目前的實驗結果看來：其一，綿繭的絲膠蛋白的含量也許是個突破口。而絲膠是繭絲之間膠著的介質，綿繭形成和絲膠蛋白有著十分密切的關系；其二，在綿繭繭層量比大造品種高的情況下，綿繭蛹體重卻與大造蛹體基本一致。由于不知綿繭與大造熟蠶體重，故而無法比較得出結果，是否存在綿繭體內含水量較高的可能性需要進一步實驗驗證。因而，下一步實驗將會圍繞尋找綿繭絲膠蛋白差異和調查綿繭吐絲過程中脫水量展開。

在目前的家蠶養(yǎng)殖生產中，家蠶上蔟時多濕的環(huán)境會造成綿繭發(fā)生概率增大。蠶繭性狀是由多基因控制，而綿繭突變體屬單基因顯性突變，即由于單基因突變致使綿繭持續(xù)穩(wěn)定發(fā)生。因而筆者推斷，突變體有可能是自身原因造成蠶繭內環(huán)境形成一個多濕的環(huán)境，從而造成綿繭形成，這個問題有待于進一步的實驗驗證。

[1]向忠懷.蠶絲生物學[M].北京：中國林業(yè)出版社，2005.

[2]向仲懷.家蠶遺傳育種學[M].北京：農業(yè)出版社，1994.

[3]Nagaraju，J.，Goldsmith，M.R.，Silkworm genomics－progress and prospects[J].Current Science，2002，83（4）：451－425.

[4]黃國瑞.繭絲學[M].北京：農業(yè)出版社，1994.

[5]Banno Y，Hujii H，Doira H.Inheritance of one cocoon shape mutant named“Floossy cocoon”of the silkworm，Bombyx mori[J].Journal of Insect Biotechnology and Sericology，2001，70：189.

[6]絲綢學院絲綢教研組.繭絲學實驗指導[M].重慶，2001.9

[7]榮海博.家蠶絲腺特異表達的bHLH轉錄因子的克隆及蛋白表達[D].重慶：西南大學，2009.