姚登福，姚 敏，蔚丹丹，嚴曉娣，陳 潔

南通大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，江蘇 南通 226001

原發(fā)性肝癌(primary hepatocarcinoma，PHC)的防治是全世界的醫(yī)學難題，近半數(shù)的肝癌病例在我國，已是僅次于肺癌的常見惡性腫瘤。肝癌形成是多基因異常、多階段發(fā)展的復雜過程。已報道的與PHC診斷相關的標志物眾多，其中血AFP為應用最廣泛的診斷標記物，但單純以AFP診斷PHC已難以滿足臨床需要，且敏感性和特異性均難令人滿意［1-2］。隨著基因組學、蛋白組學、轉(zhuǎn)錄組學等多種“組學”技術的發(fā)展，越來越多的與肝細胞惡性轉(zhuǎn)化相關分子如肝癌特異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，可明顯改進PHC診斷特異性;發(fā)現(xiàn)肝癌相關基因轉(zhuǎn)錄異常，可監(jiān)測PHC微小轉(zhuǎn)移［3-4］。本文就PHC早期診斷特異標志的研究進展作一述評。

1 分子診斷基礎

PHC是由病毒、化學致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些癌基因重新復活等諸多因素引起肝細胞生長失控而致癌變，其中數(shù)百種基因調(diào)控和表達與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關［5-6］。從PHC發(fā)生發(fā)展過程中基因表達譜分析，為探討肝癌多基因參與的復雜過程提供了新的途徑，以揭示腫瘤的發(fā)生機制，或作為早期診斷、分子分型、療效和預后判斷的依據(jù)。肝癌模型證實，鼠肝28000個基因表達譜在肝細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化早期，約有3000個基因上調(diào)，近300個基因上調(diào)幅度大于8倍;主要涉及細胞周期、炎癥相關的信號轉(zhuǎn)導、腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡抑制和抑癌基因等［7］。

伴隨肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化，蛋白表達譜發(fā)生異常改變。蛋白質(zhì)組學在研究肝癌發(fā)生機制、尋找肝癌診斷的特異性標記物和治療靶點等方面已進行了一些有意義的探索。隨著該項技術改進，相信會有靈敏、經(jīng)濟、快捷方法用于臨床，以提高肝癌早期診斷的陽性率。以表面增強的激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDITOFMS)分析良、惡肝病患者血清蛋白譜型，對PHC診斷特異性蛋白篩選有一定價值，蛋白標志的靈敏度和特異度較高，操作簡單，正確率優(yōu)于AFP［8］。

2 肝細胞惡性轉(zhuǎn)化相關蛋白

2.1 HS-AFP 以親和層析原理，從總AFP中分離出的HS-AFP(或稱AFP-L3)，占血清總 AFP的10%左右，是PHC患者血中最主要的AFP異質(zhì)體;HS-AFP增加反映HCC的惡性程度，被認為是PHC早期特異診斷的潛在分子標志;HS-AFP定量的臨床資料顯示，對肝癌診斷的特異性大于 95%［9-10］;在慢性 HBV/HCV或肝硬化患者，如HS-AFP異常，高度提示該患者可能是PHC高危人群，需要加強監(jiān)測;HS-AFP比影像學檢查早9～12個月檢測出肝硬化患者中的早期PHC。

2.2 HS-GGT HS-GGT是從總GGT分離出對肝癌診斷具有特異性的胚胎型部分(Ⅰ’、Ⅱ、Ⅱ’)，對PHC診斷的敏感性在85%左右，早期診斷價值不亞于AFP。對AFP假陰性肝癌(＜50 g/L)和小肝癌的診斷率分別為84.0%、78.6%(AFP僅為50%)。與 AFP濃度或腫瘤大小無明顯相關［11］。通過多項標志物的篩選，認為HS-GGT可作為AFP以外的最佳肝癌標志物。GGT-mRNA可望成為檢測肝細胞早期癌變的靈敏方法。肝GGT基因可分為3種亞型:即胎肝(F)、胎盤(P)和肝癌細胞(H)亞型，其中H亞型陽性可能為肝細胞的癌前期病變。

3 肝細胞相關生長因子

3.1 胰島素樣生長因子亞組分(IGF-Ⅱ) 肝臟發(fā)育過程中IGF-Ⅱ基因以啟動子、甲基化程度、印跡狀態(tài)等進行動態(tài)調(diào)節(jié)。肝臟是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官，在肝細胞癌變過程中胚胎型IGF-Ⅱ基因活化，激活已關閉的啟動子P3而產(chǎn)生胚胎表型逆轉(zhuǎn)，使IGF-Ⅱ過表達，經(jīng)IGF-Ⅰ受體上酪氨酸激酶途徑合成與活化。肝細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，IGF-Ⅱ呈進行性增加。肝癌發(fā)生早期IGF-Ⅱ異常并伴有脈管區(qū)卵圓細胞的出現(xiàn)，免疫組織化學證實小肝癌中可見IGF-Ⅱ呈強陽性表達，高達40～100倍;另外IGF-Ⅱ與PHC分化程度有關，低分化肝癌中見強陽性表達。IGF-Ⅱ表達異常與肝病患者病情嚴重程度有關，肝癌和部分癌旁組織中表達，而遠癌組織不表達［12-13］。

3.2 轉(zhuǎn)化生長因子-β 亞組分(TGF-β1)TGF-β1 是TGF-β家族的成員，是一種與正常和變異細胞生長和分化的調(diào)節(jié)有關的多功能細胞因子，具有強大而可逆的生長抑制活性以及免疫抑制作用。TGF-β1為一種多功能生長因子，在胚胎發(fā)生發(fā)展、肝細胞生長和分化過程中起重要作用，與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關［14］。肝癌模型的動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)在誘癌過程中，隨著肝細胞癌變發(fā)生，肝細胞總漿蛋白濃度變化不明顯，但TGF-β1表達進行性升高;肝細胞癌前病變組已明顯高于正常對照組;肝細胞癌變組活性達高峰。小分子TGF-β1極易釋放入血，因此血TGF-β1也顯著增加，且兩者呈明顯的正相關，提示PHC是TGF-β1高表達腫瘤，TGF-β1可能參與肝細胞癌變過程，濃度的進行性升高可反映肝細胞的早期癌變。

3.3 血管生成素亞組分(Ang-2) 血管生成是PHC生長、進展的關鍵步驟。PHC為血供豐富的惡性腫瘤，多種細胞因子過表達。Ang主要由血管內(nèi)皮細胞和血管周圍細胞合成，經(jīng)自分泌作用與細胞膜上酪氨酸激酶受體(Tie)-2特異結(jié)合，但不引起受體磷酸化和隨后的信號傳遞。Ang主要由 Ang-1和Ang-2組成，是維持血管內(nèi)皮細胞穩(wěn)定及促進血管重構(gòu)，促血管新生的血管生成因子，Ang-2與肝癌發(fā)生關系最為密切［15］。肝細胞發(fā)生癌變過程中，肝Ang-2呈進行性動態(tài)表達。肝病患者血Ang-2水平，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化患者較低，肝癌患者較高，隨肝病進展呈進行性增加，與VEGF呈顯著正相關(r=0.769);如以血Ang-2＞35 ng/mL為界，肝癌組95%異常，Ang-2過表達有助于肝癌的診斷與鑒別。

3.4 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 新血管生成是肝癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎，是癌細胞播散的途徑，促進血管滲漏。VEGF表達調(diào)控較為復雜，突變的ras癌基因可使VEGF表達增強，而ras表達抑制物可顯著降低VEGF活性;突變的P53基因可增強蛋白激酶活性，以誘導VEGF表達，保持腫瘤無限制侵襲性生長，癌組織須依賴持續(xù)廣泛的新生血管形成;VEGF與血管內(nèi)皮細胞膜兩種酪氨酸激酶受體結(jié)合發(fā)揮作用，具有促進不同來源內(nèi)皮細胞分裂、增殖和血管構(gòu)建的作用，并促進內(nèi)皮細胞、單核細胞的遷移。誘導內(nèi)皮細胞表達蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子，誘導血管形成;同時并參與促進細胞增殖的信號傳遞，與炎癥介質(zhì)間具有良好相關性，以自分泌或旁分泌而相互作用。VEGF能激活癌血管內(nèi)皮細胞增殖，可作為肝癌血管生成的早期標志［16］。

4 膜蛋白與肝癌

4.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖亞組分(肝癌特異組分，GPC-3)GPC-3在PHC發(fā)展過程中過表達，位于胞質(zhì)和胞膜，癌旁定位于胞質(zhì)，而遠癌肝組織未見表達。且癌GPC-3強度高于癌旁和遠癌肝組織，與HBV感染相關，HBsAg陽性組高于陰性組，與AFP聯(lián)檢可提高診斷率。GPC-3過表達與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、FGF2、FGFR1、FGFR2、硫酸酯酶 1(SULF1)和SULF2顯著相關，GPC-3是一種分泌型糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，半數(shù)PHC患者血中可測到GPC-3，而肝硬化、慢性肝炎和健康人血中未測出。GPC-3表達與瘤體大小有關，肝癌＜3.0 cm組明顯高于≥3.0 cm組，中、低分化癌組織GPC-3陽性率明顯高于高分化肝癌，過表達肝癌預后差［17-18］。

4.2 高爾基蛋白亞組分(GP-73)GP-73是存在于細胞高爾基體的一種跨膜蛋白，是病毒感染的肝細胞內(nèi)具有正調(diào)節(jié)作用的固有高爾基蛋白。GP-73在健康人群和非肝病患者中GP-73水平低，HBV攜帶者GP-73水平雖高于健康者和非肝病患者，但遠低于肝癌患者。肝癌患者GP-73水平是HBV攜帶者的20倍。早期PHC診斷，GP-73敏感性明顯高于AFP。GP-73主要由膽管上皮細胞表達，深入研究發(fā)現(xiàn)無論何種原因引起的肝病，患者GP-73水平均顯著上調(diào)。非肝病患者和正常人GP-73水平相近;GP-73診斷肝癌的敏感性為76.9%，特異性達92.8%，與腫瘤大小和分級未見確切關系。GP-73具有應用前景，尚須更多病例證實和長期隨訪，以及了解GP73在其他肝臟占位性病變中的表達等。肝癌患者血GP-73顯著升高，早期診斷肝癌的診斷優(yōu)于AFP，而GP-73異質(zhì)體的敏感性和特異性則高達90%、100%，可能是肝癌可靠的診斷標志物［19-20］。

4.3 膜聯(lián)蛋白A2(Annexins A2，ANXA2) 膜聯(lián)蛋白是一個鈣離子依賴的、陰離子的磷脂結(jié)合蛋白家族，故又稱為鈣磷脂結(jié)合蛋白。其家族已報道至少160種家族成員，且大多數(shù)都有重要的蛋白結(jié)合伴侶，最典型的代表就是ANXA2，其表達及蛋白翻譯后異常修飾與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關系。鑒于ANXA2在正常肝組織、PHC癌旁和PHC癌組織表達差異顯著，可將ANXA2作為肝細胞癌標志物。免疫組化分析ANXA2表達，并結(jié)合其他肝癌標志物(GPC-3和Hsp70)，可增加PHC診斷準確性，靈敏度74%，特異性100%;ANXA2作為新生血管敏感而特異性標志，加入已經(jīng)建立的診斷標準，使肝活檢診斷 PHC更可靠。血ANXA2濃度與光密度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關系，最低檢出敏感性是0.02 μg/mL。用于臨床顯示PHC病人血ANXA2濃度明顯高于正常對照，可為PHC 診斷靈敏標志［21］。

5 外周血相關基因轉(zhuǎn)錄異常

5.1 微RNA(miRNA)表達譜改變 miRNA是由21～25個核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，通過翻譯抑制或降解靶mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡、病毒感染以及癌變等多種病理生理過程中起著重要的作用。肝細胞癌是世界范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤，最新的研究表明miRNA直接參與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，且與肝細胞癌的診斷、轉(zhuǎn)移和預后等相關。Ura等以RT-PCR擴增分析了HBV和HCV相關PHC組織的188個miRNAs，發(fā)現(xiàn) has-miR-122a、-199和-223等17種低表達，與上調(diào)腫瘤相關途徑如細胞周期、黏附、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯有關;6種中高表達如 has-miR-21、98、221、222等，與下調(diào)抗腫瘤免疫等有關，miRNAs表達譜在肝癌早期診斷具有應用前景［22-23］。

5.2 IGF-Ⅱ mRNA 在肝癌發(fā)生過程中，胚胎型IGF-Ⅱ mRNA重新表達，IGF-Ⅱ表達上調(diào)。肝組織IGF-Ⅱ表達，受4個啟動子(P1～4)調(diào)控，其中胚胎型P3啟動子活化是導致IGF-Ⅱ持續(xù)表達，細胞增殖以致形成肝細胞癌的重要驅(qū)動因素，且其過高表達與P3和P4啟動子的再激活及P1啟動子失活高度相關。肝癌患者外周血 IGF-Ⅱ mRNA陽性率為34.2%，當將IGF-Ⅱ的臨界值定為4.1 mg/mL時，診斷小肝癌的敏感性為63%，特異性為90%，提示IGF-Ⅱ是小肝癌和PHC早期診斷的敏感血清標記物［13］。

5.3 TGF-β1 mRNA TGF-β1 mRNA 在肝細胞惡性轉(zhuǎn)化時進行性增高，肝癌形成時達高峰，是PHC發(fā)生、發(fā)展的分子標記。肝癌組織、癌旁組織和外周血中TGF-β1 mRNA 陽 性 率 分 別 為 100%、46.2% 和53.3%;Ⅲ期肝癌為83.3%，高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌，TGF-β1和TGF-β1 mRNA可成為PHC早期檢測的敏感標記物。血TGF-β1診斷PHC的敏感性為74.4%，特異性為77.9%，與 AFP聯(lián)檢陽性率達95.5%;對AFP陰性PHC及小肝癌的診斷陽性率也可達85.7%［14］。尿中 TGF-β1 水平與 PHC 顯著相關，對AFP陰性或低濃度PHC的診斷有較高價值。

5.4 GPC-3 mRNA GPC-3 mRNA在非肝細胞肝癌組織內(nèi)均不表達，故認為GPC-3 mRNA在AFP陰性肝癌中特異性表達，可作為PHC的新基因標志。免疫組化顯示PHC中陽性率為72%，正常肝和良性肝病未檢測到。另HCC患者血中可檢到GPC-3可溶性NH2-末端片段(sGPC-3)，將sGPC-3作為早期PHC的血清學標記物。GPC-3過表達與肝細胞惡性轉(zhuǎn)化相關，肝癌模型顯示從肝細胞顆粒樣變性、不典型增生(癌前期)及癌形成時，肝GPC-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及GPC-3梯度表達呈正相關，與組織學一致，過表達是肝細胞惡性改變的早期事件［18］。

6 展望

肝癌的手術切除仍是治療的首選方法。肝癌的惡性程度極高，早診早治和術后復發(fā)監(jiān)測是提高患者存活率的唯一途徑。肝癌形成是多基因異常、多階段發(fā)展的復雜過程，已報道的與肝癌診斷相關的標志物眾多，單純以AFP診斷肝癌，其敏感性和特異性均難令人滿意［24-25］。近來質(zhì)譜、基因表達譜、蛋白質(zhì)組學、腫瘤免疫等相關技術的應用，已篩選出一些潛在的具有診斷特異性的標志物，如HS-GGT、HS-AFP和GPC-3等。肝細胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生、發(fā)展關鍵信號通路的闡明將為肝癌的診斷帶來新的契機。多種具有診斷特異性標志物的聯(lián)合應用，可有效提高肝癌診斷的敏感性及特異性，也利于AFP陰性或低濃度肝癌的早期發(fā)現(xiàn)。

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