王秀芹，張 敏，顏 萍

(1.朝陽師范高等?？茖W校，遼寧 朝陽 122000;2.北京匯源飲料食品集團有限公司檢測中心，北京 101305;3.山東省膠州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，山東膠州 266300)

隨著科學技術(shù)的不斷提高，人民生活水平的日益增長，食品的安全問題越來越成為人們關(guān)注的焦點，食品中暴露出的問題也越來越多，人們對于食品的安全則有了更高的要求。國家對于食品衛(wèi)生的檢測力度也逐漸增強，食品微生物檢驗是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量、保證食品安全、預防和控制食源性疾病的重要手段之一。因此，食品中關(guān)于微生物檢測方法和技術(shù)的探討也顯得尤為重要。

1 分子生物學方法

1.1 PCR 檢測

PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈反應，是由Kary Mullis等人首創(chuàng)的一項體外快速擴增DNA的方法，它可使極微量的某一特定序列的DNA片斷在數(shù)小時內(nèi)特異性擴增至百萬倍以上［1］。PCR 反應是將模板 DNA、引物、Taq酶、dNTPs、鎂離子、緩沖液、雙蒸水等混合物裝在PCR微型管中，在可編程調(diào)控的PCR儀上完成。

PCR技術(shù)具有簡易、快速、靈敏和高特異性的優(yōu)點，可以擴增待檢微生物目的DNA很快判斷某種微生物是否存在。PCR技術(shù)還可以檢測那些人工無法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物，從而大大增加診斷檢查內(nèi)容和診斷能力。目前，已經(jīng)有了自動化PCR檢測試劑盒儀器，使用比較方便，但仍然需要增加一些專用的設備。PCR技術(shù)可以對特定的致病菌進行檢測，已經(jīng)成功地對沙門氏菌［2］、大腸埃希菌 O157∶H7［3］、產(chǎn)單核細胞李斯特菌［4］等致病菌進行了有效測定。PCR技術(shù)也存在著假陽性問題、假陰性問題以及定量困難的問題，所以還不能成為一種常規(guī)檢測方法。

1.2 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是用同位素或其他的標記方法對已知核苷酸序列DNA片段進行標記，將其加入到已變異的DNA樣品。這樣在一定的條件下就能和這種樣品的同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙聯(lián)，達到鑒定DNA的目的。核酸探針檢測技術(shù)具有特異性、敏感性的優(yōu)點，但也存在一些問題，如一種菌需要制備一種探針;對樣品進行一段時間的培養(yǎng)才能達到檢測量;對毒素污染的不含產(chǎn)毒菌的食品無法檢測［5］。

2 代謝學技術(shù)

2.1 電阻抗技術(shù)

電阻抗技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項生物學技術(shù)，已經(jīng)開始應用于微生物的檢測。它是指細菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖的過程中，將會使培養(yǎng)基中的大部分電惰性物質(zhì)，代謝為具有電活性的小分子物質(zhì)，其能增加培養(yǎng)基的導電性，使阻抗發(fā)生變化，通過檢測培養(yǎng)基的電阻抗變化來判定細菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。該方法已用于食品中細菌總數(shù)、大腸埃希菌、沙門氏菌等［6］微生物的檢測，且具有高敏感性、特異性、快速反應性和高度重復性等優(yōu)點。

2.2 微熱量計技術(shù)

微熱量計技術(shù)是通過細菌生長時熱量的變化對細菌進行檢出和鑒別。微生物在生長過程中產(chǎn)生熱量，用微熱量計測量產(chǎn)熱量等數(shù)據(jù)，存儲于計算機中，經(jīng)過適當信號上的數(shù)字模擬界面，在記錄器上繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖，與已知細菌熱曲線圖比較，即可對細菌進行鑒別。目前，應用該技術(shù)研究細菌的抑制作用［7］。

2.3 放射測量技術(shù)

放射測量技術(shù)(RM)是物理與化學診斷一體的新型檢測技術(shù)，主要用于培養(yǎng)基中微生物的檢驗。根據(jù)細菌在生長繁殖過程中代謝碳水化合物產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性14C標記引入碳水化合物或鹽類等底物分子中進行檢測的技術(shù)［8］。細菌生長時，這些底物被利用并釋放出含放射性的14CO2，然后自動化放射測定儀Bactec測量14CO2的含量，來判斷細菌的數(shù)量。本方法具有快速、準確度高和自動化等優(yōu)點。放射測量技術(shù)已經(jīng)被應用于大腸埃希菌的定量檢測。

3 免疫分析檢測

3.1 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence Technique)就是用熒光素標記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學標記技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標記抗體通稱為熒光抗體。實際應用上主要有直接法和間接法。直接熒光抗體檢測法是在檢樣上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加已知細菌特異性抗血清，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標記的抗體后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果?？捎脕韺ι抽T氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.coli O157和單核細胞增生李斯特氏菌等進行快速檢測。王軍等［9］建立了養(yǎng)殖大黃魚病原溶藻弧菌的間接熒光抗體免疫快速檢測技術(shù)。該技術(shù)的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。但是還存在一定的不足，如非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序比較復雜。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) ELISA技術(shù)(enzyme，linked fluorescent immunoassay)，全稱熒光酶標免疫分析，最早出現(xiàn)于19世紀70年代，它是在酶聯(lián)免疫吸附分析的基礎上發(fā)展起來的一種快速、先進的現(xiàn)代食品微生物分析檢測方法，最近幾年出現(xiàn)了更靈敏的顯色劑和底物，提高了ELISA的有效性。ELISA技術(shù)是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。它結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫測定法2種技術(shù)的優(yōu)點，具有可定量、反應靈敏準確、標記物穩(wěn)定、適用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡便完全、檢測速度快以及費用低等特點，可同時進行上千份樣品的分析。近年來，ELISA技術(shù)已經(jīng)逐步應用與食品中大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等方面的檢測分析［10］。

酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)是將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析的基礎上用理想的熒光底物代替生色底物，可提高分析的靈敏度和增寬測量范圍，減少試劑的用量。酶放大技術(shù)、同相分離及熒光檢測三者的聯(lián)合將成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。

4 分析化學技術(shù)

分析化學技術(shù)的不斷更新，使儀器分析手段和方法在微生物檢測方面取得了一定的地位。如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS/MS)等。這些方法不同于依賴微生物生物學特征的檢測方法，而是通過分析微生物的化學組成(生物標志物)來區(qū)分和鑒定微生物，開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。例如:氣相色譜分析是利用微生物細胞分離的方法研究微生物分類的。其原理是將微生物細胞經(jīng)過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后使之分離盡可能多的化學組分供氣相色譜儀進行分析。得到特征峰來進行微生物鑒定。大量分析檢測各種常見細菌、酵母菌、霉菌和其他微生物的組成成分，并建立微生物組分標準色譜圖文庫，然后將待鑒定微生物的組分色譜圖與標準圖譜相比較，迅速鑒定其種類［11］。

5 展望

伴隨著微生物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進步，檢測的方法也越來越多樣化，除了上述介紹的幾種方法以外還包括基因芯片檢測、流式細胞術(shù)、免疫磁性微球等檢測方法。每一種檢測方法都有其自己的優(yōu)點和缺點，在檢測時要根據(jù)自己的實際情況選擇適合的方法，還可以適當?shù)倪x擇幾種方法結(jié)合起來使用，以提高檢測的準確性。

目前食品安全是一個重大的世界性公共衛(wèi)生問題，不僅影響到人類的健康，而且關(guān)系到國家的穩(wěn)定。雖然病菌不斷的進化，但是檢測方法也在不斷的改進，相信在不久的將來會研發(fā)出更加簡單快速的病原微生物檢測方法和檢測體系，為社會的飲食安全把好關(guān)，這也必將為人類的公共衛(wèi)生、營養(yǎng)健康、飲食習慣與疾病預防事業(yè)做出巨大的貢獻。今后食品微生物檢驗技術(shù)將會向高效率、高標準、高精準度、高靈敏度的方向發(fā)展。

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