任 芳，史惠蓉，陳志敏，樊冬梅，劉慧娜，紀(jì) 妹，韓麗萍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南鄭州 450052)

卵巢癌是女性生殖器官3大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，5年生存率僅25%～30%，已成為威脅婦女生命和健康的主要原因。卵巢癌由于缺乏早期診斷方法，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已屬晚期，且有約60%～70%患者在治療中發(fā)生耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，尋找能早期診斷及判斷預(yù)后的相關(guān)因子，以及有效治療靶點(diǎn)是目前卵巢癌研究的重點(diǎn)。肝癌缺失因子-1(deleted in liver cancer-1，DLC-1)［1，2］是一種腫瘤抑制基因，與細(xì)胞凋亡、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一類非受體型胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，分布在細(xì)胞粘著斑部位［3］。信號(hào)分子p130Crk相關(guān)底物(Crk-associated substrate 130 kDa，p130Cas)是一種高度磷酸化的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［4，5］。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)DLC-1、FAK和p130Cas在正常卵巢組織及卵巢上皮性癌中的表達(dá)，分析3者在卵巢上皮性癌中表達(dá)之間的相關(guān)性及其與卵巢癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，探討DLC-1、FAK和p130Cas的檢測(cè)對(duì)于卵巢上皮性癌早期診斷和預(yù)后分析存在的潛在價(jià)值。

1 臨床資料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年至2008年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科手術(shù)存檔蠟塊，其中正常卵巢組織(因子宮肌瘤而行卵巢切除者)22例，卵巢上皮性癌62例。62例卵巢癌患者的年齡19～73歲，中位年齡50歲。所有標(biāo)本均為初次診斷，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療和化療。

1.2 主要試劑 山羊抗人DLC-1多克隆抗體(ab21200，稀釋濃度為1∶100)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;鼠抗人FAK單克隆抗體(SC-1688，稀釋濃度為1∶50)為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;p130Cas鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司;免疫組化SP、PV試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.3 免疫組織化學(xué)方法 常規(guī)4 μm厚度連續(xù)切片、貼片、脫蠟。免疫組織化學(xué)染色按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行。所有切片染色均在相同條件下進(jìn)行，每批染色均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果判定:以胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。染色強(qiáng)度:無(wú)著色(0分);染色淡黃(1分);染色黃(2分);染色棕黃(3分)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的百分比≤5%(0分);5%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的百分比≤25%(1分);25%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的百分比≤50%(2分);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的百分比＞50%(3分)。最終評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)分值可將染色結(jié)果分為:陰性:0-1分;陽(yáng)性:＞2分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearmen等級(jí)相關(guān)分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中的表達(dá)情況 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為54.8%、79.0%和87.1%;在正常卵巢組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%、27.3%和31.8%。DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌中的表達(dá)與正常卵巢組織相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 DLC-1和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)

2.2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 DLC-1蛋白的表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期、有無(wú)腹水和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與組織學(xué)類型、分化程度和年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)。FAK蛋白的表達(dá)與卵巢癌的分化程度、有無(wú)腹水和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。p130Cas蛋白的表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表2。

2.3 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 DLC-1與FAK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－3.08，P=0.015)。DLC-1和p130Cas蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=－0.330，P=0.006)。

表2 DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

3.1 DLC-1在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其意義 肝癌缺失基因(DLC-1)是1998年采用再現(xiàn)差異分析法發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，在人類多種腫瘤中呈低表達(dá)或表達(dá)缺失。DLC-1蛋白是RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激動(dòng)蛋白，參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，與細(xì)胞凋亡、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及細(xì)胞骨架形成關(guān)系密切［6，7］。

Kim等［2］對(duì)肝癌細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)DLC-1的過(guò)表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的移行。Peng等［8］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中DLC-1的表達(dá)與腫瘤局部浸潤(rùn)的范圍有關(guān)。而卵巢癌組織中的DLC-1表達(dá)情況報(bào)道很少。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中DLC-1蛋白表達(dá)明顯低于正常卵巢組織(P＜0.05)，表明DLC-1的低表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。在臨床期別晚、有腹水、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，DLC-1表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，表明DLC-1與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有直接關(guān)系。國(guó)外研究［9，10］發(fā)現(xiàn)肝癌和乳腺癌細(xì)胞系中DLC-1的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用，也從另一角度支持本研究的發(fā)現(xiàn)。

3.2 FAK在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其意義 粘著斑激酶(FAK)是一個(gè)多功能的非受體酪氨酸激酶，它在細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用，在許多腫瘤組織中都有FAK表達(dá)增加。FAK激活后，介導(dǎo)整合素、FAK/Src等多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)參與細(xì)胞的分化、增生以及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等過(guò)程［11，12］。

Fujii等［13］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在肝癌組織中呈過(guò)度表達(dá);另外，Aalbers等［14］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中FAK的高表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究顯示，卵巢癌中FAK蛋白的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織(P＜0.05)。在腫瘤分化程度低、有腹水、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，F(xiàn)AK表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。表明高表達(dá)的FAK可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)化，且與卵巢癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.3 p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其意義

p130Cas最初在癌基因V-src和V-crk轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中鑒定出來(lái)的一個(gè)高度磷酸化的蛋白質(zhì)［4，5］。作為整合素通路中關(guān)鍵的信號(hào)分子，p130Cas不僅參與細(xì)胞黏附、遷移、存活和增生等一系列的生理過(guò)程，還在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

Wei等［4］發(fā)現(xiàn)p130Cas與肺癌細(xì)胞的抗失巢生長(zhǎng)密切相關(guān)。Wendt等［5］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，p130Cas表達(dá)的降低能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞侵襲和早期的遠(yuǎn)處播散。本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢上皮性癌組織中p130Cas的蛋白表達(dá)明顯高于正常卵巢組織。在臨床期別晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中，p130Cas表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。提示p130Cas在卵巢上皮性癌組織中的高表達(dá)可能與卵巢癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和病程進(jìn)展有關(guān)。

3.4 DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 DLC-1定位于局部黏著斑，因此要發(fā)揮其腫瘤抑制活性，對(duì)局部黏著斑的定位是必需的［15］。Kim等［2］在肝細(xì)胞癌中研究發(fā)現(xiàn):DLC-1可導(dǎo)致局部黏著斑蛋白如黏著斑激酶(FAK)、信號(hào)分子p130Crk相關(guān)底物(p130Cas)以及樁蛋白(paxillin)的去磷酸化，從而抑制癌細(xì)胞的遷移。p130Cas是局部黏著斑形成和細(xì)胞遷徙所必要的局部黏著斑復(fù)合體相關(guān)蛋白。DLC-1使p130Cas酪氨酸去磷酸化，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞遷徙能力下降。同時(shí)，DLC-1表達(dá)引起FAK的去磷酸化失活，抑制了粘著斑的形成，使腫瘤細(xì)胞粘附性降低，從而誘導(dǎo)凋亡。以上均說(shuō)明DLC-1抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的作用可能是通過(guò)對(duì)FAK和p130Cas去磷酸化實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)在卵巢上皮性癌中，DLC-1和FAK及p130Cas中的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。初步說(shuō)明3者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。推測(cè)低表達(dá)的DLC-1通過(guò)使FAK及p130Cas去磷酸化，從而在卵巢上皮性癌的發(fā)生尤其是浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。3者在卵巢癌中的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示在卵巢上皮性癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中，3者可能發(fā)揮某種重要的協(xié)同作用，尚有待于進(jìn)一步的研究。本研究初步確定了DLC-1和FAK及p130Cas在卵巢上皮性癌中的表達(dá)以及與各臨床病理特征之間的關(guān)系，在一定程度上揭示卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展中可能存在的分子生物學(xué)機(jī)制，3者蛋白表達(dá)之間負(fù)調(diào)控的關(guān)系為抑制卵巢惡性腫瘤發(fā)展提供一個(gè)很好的理論基礎(chǔ)，為更好的尋求新的治療靶點(diǎn)提供廣闊的思路，在卵巢上皮性癌的臨床治療尤其是對(duì)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的干預(yù)方面可能有潛在的臨床價(jià)值。

［1］ Liao Y C，Lo S H.Deleted in liver cancer-1(DLC-1):a tumor suppressor not just for liver［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(5): 843-847.

［2］ Kim T Y，Lee J W，Kim H P，et al.DLC-1，a GTPase-activating protein for Rho，is associated with cell proliferation，morphology，and migration in human hepatocellular carcinoma［J］.BiochemBiophys Res Commun，2007，355(1):72-77.

［3］ Golubovskaya V M，Kweh F A，Cance W G.Focal adhesion kinase and cancer［J］.HistolHistopathol，2009，24(4):503-510.

［4］ Wei L，Yang Y，Zhang X，et al.Anchorage-independent phosphorylation of p130(Cas)protects lung adenocarcinoma cells from anoikis［J］.J Cell Biochem，2002，87(4):439-449.

［5］ Wendt M K，Smith J A，Schiemann W P.p130Cas is required for mammary tumor growth and transforming growth factor-beta-mediated metastasis through regulation of Smad2/3 acti-vity［J］J BiolChem，2009，284(49):34145-34156.

［6］ Zhou X，Zimonjic D B，ParkS W，et al.DLC-1 suppresses distant dissemination of human hepatocellular carcinoma cells in nude mice through reduction of RhoAGTPase activity，actin cytoskeletal disruption and down-regulation of genes involved in metastasis［J］.Int J Oncol，2008，32(6):1285-1291.

［7］ Wong C C，Wong C M，KoF C，et al.Deleted in liver cancer 1(DLC-1)negatively regulates Rho/ROCK/MLC pathway in hepatocellular carcinoma［J］.Plos One，2008，3(7):2779.

［8］ Peng H，Zhao T，Yao K.Study of DLC-1 gene expression in nasopharyngeal carcinoma［J］.ZhonghuaEr Bi Yan HouKeZa Zhi，2002，37 (6):454-457.

［9］ Wong C M，Yam J W，Ching Y P，et al.RhoGTPase-activating protein deleted in liver cancer suppresses cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2005，65:8861-8868.

［10］Goodison S，Yuan J，Sloan D，et al.The RhoGAP protein DLC-1 functions as a metastasis suppressor in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2005，65:6042–6053.

［11］ Zhao J，Guan J L.Signal transduction by focal adhesion kinase in cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2009，28(1-2):35-49.

［12］Chatzizacharias N A，Kouraklis G P，Theocharis S E.Clinical significance of FAK expression in human neoplasia［J］.Histol Histopathol，2008，23(5):629-50.

［13］Fujii T，Koshikawa K，Nomoto S，et al.Focal adhesion kinase is overexpressed in hepatocellular carcinoma and can be served as an independent prognostic factor［J］.J Hepatol，2004，41(1):104-111.

［14］de Heer P，Koudijs M M，van de Velde C J，et al.Combined expression of the non-receptor protein tyrosine kinases FAK and Src in primary colorectal cancer is associated with tumor recurrence and metastasis formation［J］.Eur J SurgOncol，2008，34(11):1253-1261.

［15］Liao Y C，ShihY P，LoS H，et al.Mutations in the focal adhesion targeting region of deleted in liver cancer-1 attenuate their expression and function［J］.Cancer Res，2008，68(19):7718-7722.