劉素娜，張 艷，張晶敏，韓 立，江金花，周玉冰，王慶端

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室 河南鄭州 450052; 3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院 河南鄭州 450001)

細(xì)胞周期蛋白(cyclins)是參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子［1，2］。Cyclin E蛋白是cyclins中調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白質(zhì)，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期過渡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。有研究證實(shí)，抑制cyclin E的表達(dá)可控制細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展［3，4］。Cyclin E通過促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展起重要作用［5］，其蛋白的表達(dá)可作為判斷腎透明細(xì)胞癌預(yù)后分子指標(biāo)［6］。本實(shí)驗(yàn)采用以管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，繪制目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立用SYBR Green I熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)cyclin E表達(dá)方法，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究及cyclin E靶點(diǎn)基因腫瘤治療建立良好的相對(duì)定量測(cè)定 cyclin E mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株 H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。SPF KM小鼠15只，18～22 g，6～8周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2009-0004。小鼠在溫度20℃，濕度55%的IVC獨(dú)立供風(fēng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 建立H22肝癌動(dòng)物模型 收集傳代第7～8天的H22肝癌細(xì)胞，用PBS洗兩次，0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至1.2×107/ml接種于KM小鼠右腋下，每只動(dòng)物接種0.2 ml，18 d后剖瘤稱重，將介于1.5～2.2 g瘤體的瘤體共12例－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量 PCR檢測(cè)Cyclin E和β-actin mRNA的表達(dá)。

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成:應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，查閱出cyclin E與β-actin的GenBank收錄號(hào)分別為NM-007633.2和NM-007393.3，利用Primer5.0設(shè)計(jì)cyclin E引物，引物序列見表1。

1.3.2 瘤組織總RNA的提取及樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄用Trizol提取組織RNA，具體方法按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作。將提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的RNA濃度?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄過程按照TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 Cyclin E和β-actin PCR基因引物序列

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備:用反轉(zhuǎn)錄的 cDNA產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，隨機(jī)取提取的1例RNA樣本，用總RNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行cDNA合成。取反轉(zhuǎn)錄后樣本的cDNA，進(jìn)行10倍梯度稀釋(100～10－7)，檢測(cè)反應(yīng)靈敏性，作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品使用。

1.3.4 熒光定量PCR反應(yīng):采用熒光定量PCR法對(duì)cyclin E和β-actin進(jìn)行檢測(cè)。將 RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增10倍梯度稀釋，即取cyclin E和β-actin cDNA(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，ddH2O作陰性對(duì)照。定量PCR反應(yīng)體系:2 ×SYBR Green I Mix 10 μl，上、下游引物各0.8 μl，標(biāo)準(zhǔn)品cDNA 1 μl，加ddH2O 7.4 μl至20 μl反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件:95℃ 預(yù)變性10 s;95℃變性5 s，Cyclin E和β-actin分別53℃、51℃退火20 s，72℃延伸15 s并讀取熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)，每步的溫度轉(zhuǎn)換速度是20℃/s;熔解曲線分析:95℃2 s，60℃40 s，以0.2℃/ s加熱至95℃，冷卻至40℃停止。反應(yīng)結(jié)束用Roche LightCycler 1.5分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 PCR產(chǎn)物特異性、重復(fù)性和精密度測(cè)量 對(duì)熒光定量PCR的熔解曲線進(jìn)行分析，并將其擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和反應(yīng)特異性。將 cyclin E和β-actin 10－4的 cDNA標(biāo)準(zhǔn)品平行操作6次，同時(shí)在6 d內(nèi)分別測(cè)定，獲得日間CV和批內(nèi)CV。

2 結(jié)果

2.1 H22肝癌動(dòng)物模型的建立 將接種瘤細(xì)胞的小鼠7天后進(jìn)行解剖，取瘤體稱重，瘤重在1.5～2.2 g之間，成功的建立了H22肝癌動(dòng)物模型。

2.2 瘤組織總RNA的提取及PCR產(chǎn)物檢測(cè) 將提取的瘤組織總RNA進(jìn)行A260/280比值和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，A260/280的比值介于1.7～2.0之間，同時(shí)電泳圖顯示有明顯的28 s、18 s和5 s帶型，結(jié)果說明提取的總RNA純度和完整性良好。如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1A)為合成長(zhǎng)度(74 bp)的目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1B)為合成長(zhǎng)度(197 bp)的內(nèi)參基因片段。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取倍比稀釋后(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)的cyclin E和β-actin的cDNA制作PCR擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線(圖2，圖3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線r均為－1.00，說明模板濃度和Ct值相關(guān)性良好。二者的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為slop=－3.499和slop=－3.572，PCR擴(kuò)增效率E=10［－1/slop］－1，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增效率分別為0.91和0.93，擴(kuò)增效率高且基本一致;熔解曲線為單峰，說明無引物二聚體生成;擴(kuò)增曲線梯度良好。

圖1 Cyclin E(A)和β-actin(B)PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 β－actin熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(A)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)和熔解曲線(C)

2.4 PCR產(chǎn)物的特異性、重復(fù)性與精密度 Cyclin E和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的Tm值分別為(81.84± 0.28)℃和(89.15±0.26)℃，熔解曲線均呈單峰，說明無引物二聚體生成。SYBR Green I熒光定量PCR方法檢測(cè)Cyclin E 10－4cDNA的標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)和日間Ct值的均值分別為28.37和 28.26，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.29和0.41，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和日間CV分別為1.02%和1.45%;β-actin 10－4cDNA的標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)和日間Ct值的均值分別為21.07和21.01，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.19和0.31，批內(nèi)CV和日間CV分別為0.90%和1.48%。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)誕生于九十年代中期，因其定量準(zhǔn)確，檢測(cè)范圍寬，敏感性高，精確度高，無PCR后處理步驟，產(chǎn)出率高且可以進(jìn)行多重檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)［7］，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等諸多研究領(lǐng)域。FQ-PCR的熒光探針法主要有兩大類，一類是非序列特異性熒光染料SYBR Green I法，另一類是可以與目的DNA特異結(jié)合的TaqMan探針法。雖然TaqMan探針具有較高的特異性，在許多研究應(yīng)用中序列特異的熒光探針(如TaqMan)被看作是標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)模式［8，9］，但其合成探針費(fèi)用昂貴，所以它不適合用于對(duì)大量不同基因序列進(jìn)行定量。SYBR Green I是一種價(jià)格低廉的熒光素，它能夠非特異嵌合于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，結(jié)合狀態(tài)的發(fā)射熒光。應(yīng)用SYBR GreenⅠ的熒光定量PCR方法經(jīng)濟(jì)，只需合成序列特異引物。其自身的特異性相對(duì)較差及易受引物二聚體影響的缺點(diǎn)，通過摸索優(yōu)化反應(yīng)條件，并用熔解曲線和凝膠電泳證實(shí)并克服。所以本研究選擇用SYBR Green I作為熒光染料，試圖建立一種方便快捷、特異性高且成本較低的基因定量檢測(cè)方法。

本實(shí)驗(yàn)采用將RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增得到的cDNA 10倍梯度稀釋，成功的建立了目的基因和管家基因的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線，不需要構(gòu)建質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在降低實(shí)驗(yàn)成本縮短實(shí)驗(yàn)周期的同時(shí)，避免了用膠回收基因片段或質(zhì)粒載體構(gòu)建基因片段由于與目標(biāo)cDNA結(jié)構(gòu)不同所帶來的擴(kuò)增效率不一致現(xiàn)象。熒光定量PCR的模板定量分相對(duì)定量和絕對(duì)定量。定量PCR并非完全是測(cè)定基因的絕對(duì)數(shù)量。本研究是采用相對(duì)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，選取管家基因β-actin作為參比基因來對(duì)所用樣品進(jìn)行歸一化處理［10］，計(jì)算在一定樣本中目的序列相對(duì)于另一參照樣本量的變化量。本實(shí)驗(yàn)建立的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法cyclin E基因熒光定量PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)品的制備方便易得，降低了實(shí)驗(yàn)成本同時(shí)較大的減少了系統(tǒng)誤差。

總之，本文建立的檢測(cè)小鼠肝癌模型cyclin E mRNA相對(duì)表達(dá)水平的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、靈敏度高、特異性好，為cyclin E的進(jìn)一步研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)可以推廣應(yīng)用于到腫瘤學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域相關(guān)基因定量研究。

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