徐先棟,謝珍玉,歐陽吉隆,王世鋒,周永燦

(1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院,海南 海口 570228;2.海南大學(xué) 海洋生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,海南 ?？?570228;3.海南大學(xué) 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?570228;4.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所,江西 南昌 330039)

石斑魚(Epinephelus)屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephelus)的種類[1]。其肉質(zhì)鮮美,價(jià)格昂貴,是海南等中國南方地區(qū)主要的海水養(yǎng)殖魚類之一。隨著石斑魚養(yǎng)殖的發(fā)展,其病害問題也日益突出,目前國內(nèi)外報(bào)道較多的主要包括赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelus akaara)[2-3]、點(diǎn)帶石斑魚(E.malabaricus)[4-5]和斜帶石斑魚(E.coioides)[6-7]等石斑魚疾病,對這些種類的養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重威脅。褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)俗稱老虎斑,是海南近年來新增的且已成為當(dāng)前深受歡迎的石斑魚養(yǎng)殖品種,有關(guān)其病害鮮見報(bào)道。2008年6月,在海南陵水新村港某海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場發(fā)生了褐點(diǎn)石斑魚爆發(fā)性死亡,該病發(fā)病急、傳播快、死亡率高、危害大。從初次出現(xiàn)發(fā)病癥狀到死亡高峰只要2～3 d,最高死亡率可達(dá) 90%以上。病魚主要癥狀為身體兩側(cè)的鱗片脫落,當(dāng)?shù)貪O民因此稱之為“脫鱗病”;此外,還伴有局部體表潰瘍以及爛尾和爛鰭等癥狀(圖1)。剖開腹腔可見膽囊破裂,膽汁浸染體腔,肝脾腫大,腹腔有淡黃色腹水(圖2)。作者對引起該病的病原進(jìn)行了研究,以期為該病的控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患病褐點(diǎn)石斑魚取自海南陵水新村港某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場,為具有典型患病癥狀的瀕死個(gè)體。病魚體長為12～14cm,體質(zhì)量30～35 g。感染試驗(yàn)用褐點(diǎn)石斑魚購自海南文昌某石斑魚養(yǎng)殖場,選擇活力好、無患病史、體長 12～14cm、體質(zhì)量30～36 g(平均32.5 g)的健康個(gè)體,暫養(yǎng)7 d后用于相關(guān)試驗(yàn)。

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)標(biāo)準(zhǔn)菌株由泰國漁業(yè)部宋卡濱海水產(chǎn)動(dòng)物健康研究所 Jirapora Kassornchaada博士惠贈(zèng)。

圖1 脫鱗病褐點(diǎn)石斑魚外部癥狀Fig.1 The external symptom of E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

圖2 脫鱗病褐點(diǎn)石斑魚內(nèi)部癥狀Fig.2 The internal symptom of E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

1.2 細(xì)菌分離

從體表潰瘍、肝臟、腎臟和脾臟等部位取樣,接種于2216E海水平板和TCBS平板[8],28℃培養(yǎng)24 h后記錄結(jié)果。挑取優(yōu)勢菌以 2216E海水平板純化 2次后,斜面保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)將優(yōu)勢菌株培養(yǎng)液與等體積80%甘油混合,于-80℃冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌確定

健康褐點(diǎn)石斑魚暫養(yǎng)7 d后,分組飼養(yǎng)于45cm ×35cm × 40cm(長×寬×高)的水族箱中,每箱 5 尾。每天正常投喂石斑魚人工配合飼料,日換水量為水體的1/3。將從患病褐點(diǎn)石斑魚中分離的優(yōu)勢菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),用無菌生理鹽水配制1.1×106CFU/mL 的菌懸液,腹腔注射接種健康褐點(diǎn)石斑魚,接種量 0.2 mL/尾,對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水,每組 5尾并各設(shè)置1個(gè)重復(fù)。記錄感染后15 d內(nèi)各組石斑魚的發(fā)病及死亡情況,并從感染患病個(gè)體進(jìn)行細(xì)菌分離,根據(jù)柯赫法則確定病原菌。

1.4 病原菌的菌種鑒定

1.4.1 表型鑒定

病原菌經(jīng)進(jìn)一步純化后,參照 Mercedes-Anicel方法[9]和東秀珠等[10]的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化檢測鑒定。生化鑒定管及相關(guān)試劑均購自杭州微生物有限公司。

1.4.2 16S rDNA序列測定與分析

病原菌經(jīng)振蕩培養(yǎng)24 h后,參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)[11]的方法提取細(xì)菌總 DNA,對病原菌的16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增與測序：

正向引物 Pf：5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’

反向引物 Pr：5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3’

擴(kuò)增目的片段大小約為1.5 kb。

PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：ExTaqDNA 聚合酶 (5 U/μL,含 Mg2+)0.3 μL,dNTP 4 μL,10 × PCR 緩沖液5 μL,正向引物 Pf(10 μmol/L)1 μL,反向引物 Pr(10 μmol/L)1 μL,DNA模板 2 μL,加超純水至總體積 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min、57 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 90 s,30個(gè)循環(huán);最后于72 ℃溫育10 min。1%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。采用大連寶生物(Takara)公司的 DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。連接pMD19-T Vector,篩選陽性克隆送Takara公司進(jìn)行核苷酸序列測定。采用MEGA 4.1軟件將待檢菌株的16S rDNA序列與從GenBank中獲得的同源性最高的細(xì)菌16S rDNA 序列進(jìn)行多序列匹配排列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 病原菌對褐點(diǎn)石斑魚LD50值測定

病原菌經(jīng)2216E液體培養(yǎng)基28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h后,離心分離細(xì)菌并以無菌生理鹽水制備以下 5種濃度的菌懸液：2.4 × 103、2.4 × 104、2.4 × 105、2.4 ×106、2.4 × 107CFU/mL。試驗(yàn)共分6組,每組設(shè)置一個(gè)重復(fù);其中5組為感染組,各感染組依次分別以腹腔注射接種上述菌液;對照組腹腔注射無菌生理鹽水。每組接種5尾,接種量0.2 mL/尾。連續(xù)15 d觀察記錄各組石斑魚發(fā)病和死亡數(shù)量,測定致病菌株對健康褐點(diǎn)石斑魚的LD50值[12]。

1.6 藥敏試驗(yàn)

選取杭州微生物有限公司生產(chǎn)的 25種藥敏紙片,分別檢測抑菌圈直徑,參照抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[13]確定各種藥物對病原菌株的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

細(xì)菌分離結(jié)果表明,從病魚的肝臟、脾臟和腎臟都分離到大量的細(xì)菌,并且,所分離細(xì)菌的菌落形態(tài)一致：圓形、表面光滑、半透明,經(jīng)24 h培養(yǎng)的菌落直徑約1 mm。TCBS培養(yǎng)24 h的菌落呈黃色,直徑約1 mm。從病灶處也分離到大量細(xì)菌,其中大部分菌落的形態(tài)與從肝臟等部位分離的細(xì)菌相同,夾雜有少量其他形態(tài)的菌落。分別挑取從病魚肝、脾、腎組織分離的 3株細(xì)菌,分別命名為 XC08061、XC08062、XC08063。

2.2 病原菌確定

以 1.1 × 106CFU/mL 的 XC08061、XC08062和XC08063菌液分別對30 ～ 35 g的健康褐點(diǎn)石斑魚進(jìn)行人工感染,結(jié)果表明(表1)：所有 3株菌株均可使感染石斑魚致病,感染后3 d以內(nèi)的死亡率70%以上,其中菌株XC08061的感染死亡率達(dá)100%。3 d內(nèi)未死亡的個(gè)體,至15 d內(nèi)也不再死亡。人工感染1 d內(nèi)死亡的個(gè)體,其腹腔內(nèi)有淡黃色積液、體側(cè)有局部鱗片脫落現(xiàn)象;感染后2 d內(nèi)死亡的個(gè)體鱗片脫落和腹水的癥狀更加明顯。從人工感染患病個(gè)體的肝臟、脾臟和腎臟也分離到大量與感染菌株菌落形態(tài)相同的細(xì)菌。根據(jù)科赫法則,判定上述三株細(xì)菌均為褐點(diǎn)石斑魚脫鱗病的病原菌。

表1 3株細(xì)菌對斜帶石斑魚的感染結(jié)果Tab.1 The artificial infection results of healthy E.fuscoguttatus by three bacterial strains isolated from E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 表型鑒定

對菌株 XC08061、XC08062和 XC08063的形態(tài)和生理生化特征鑒定結(jié)果表明(表2),3株細(xì)菌的生化特征非常接近,只有40℃生長、L-阿拉伯糖及蔗糖利用三指標(biāo)存在差別：具體為：菌株 XC08062在40℃下能夠生長、蔗糖利用為陰性,其余2株細(xì)菌在40℃下不生長,蔗糖利用為陽性;菌株XC08061的L-阿拉伯糖試驗(yàn)呈陽性,其余2株細(xì)菌為陰性。與哈氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的相關(guān)形態(tài)和生理生化特征相比,菌株 XC08063與標(biāo)準(zhǔn)菌株完全一致,而菌株XC08061、XC08062僅分別在L-阿拉伯糖、蔗糖和 40℃培養(yǎng)結(jié)果存在差異,其余指標(biāo)完全相同。

2.3.2 16S rDNA序列測定與分析

分別以菌株 XC08061、XC08062、XC08063的總DNA為模板,經(jīng)細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增均獲得約 1500 bp的基因片段,對其測序并提交Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫,登錄號(hào)分別為GQ180184、GQ180185、GQ180186。將這 3株菌株的基因序列與 Genbank中同源性最高的及親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的共29株其他菌株的基因序列進(jìn)行同源性比對和多序列匹配排列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3),結(jié)果表明,該 3株菌與 5株哈氏弧菌聚為一支,置信度達(dá)100%,同親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的鰻弧菌(V.anguillarum)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、河流弧菌(V.fluvialis)分支明顯。結(jié)合生化鑒定和表型特征,可以判定菌株XC08061、XC08062、XC08063均為哈氏弧菌。

2.4 病原菌對褐點(diǎn)石斑魚的LD50值測定

根據(jù)表1的結(jié)果,取感染實(shí)驗(yàn)中死亡率最高的株菌XC08061,測定其對體質(zhì)量為30～35 g的健康褐點(diǎn)石斑魚的LD50值。結(jié)果表明(表3),接種濃度為4.8 ×105CFU/尾時(shí),實(shí)驗(yàn)魚死亡率達(dá)100%;接種濃度為4.8 × 102CFU/尾時(shí),實(shí)驗(yàn)魚死亡率為 0。經(jīng)計(jì)算,該菌株對體質(zhì)量為 30～35 g的褐點(diǎn)石斑魚 LD50值為5.8 × 102CFU/g 魚體質(zhì)量。

2.5 藥敏試驗(yàn)

選取25種抗菌藥物分別對菌株XC08061進(jìn)行藥敏檢測,結(jié)果表明(表4),該菌株只對新生霉素、頭孢噻肟、先鋒必/舒巴坦、諾氟沙星、依諾沙星和慶大霉素6種抗菌藥物敏感;對卡那霉素、頭孢膚肟、呋喃妥因等6種抗菌藥物中度敏感,對鏈霉素、先鋒霉素V、乙酰螺旋霉素等13種抗菌藥物均不敏感,總體具有較強(qiáng)的耐藥性。

3 討論

褐點(diǎn)石斑魚脫鱗病是近年來海南陵水等地褐點(diǎn)石斑魚養(yǎng)殖中常見的爆發(fā)性疾病,該病爆發(fā)速度快、死亡率高,對海南褐點(diǎn)石斑魚養(yǎng)殖造成了巨大的危害。作者從病魚的肝臟、脾臟和腎臟組織中分離了XC08061、XC08062和 XC08063共3株細(xì)菌,回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明它們均屬于該病的病原菌。該 3株菌雖然在生理生化檢測結(jié)果與哈氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最為接近,但前兩個(gè)菌株的個(gè)別檢測指標(biāo)與哈氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株還存在差異。Mercedes等[9]及Noguerola等[14]認(rèn)為,細(xì)菌生化鑒定的一些指標(biāo)存在可變性,以其判定細(xì)菌種類具有一定的不確定性,為此,作者進(jìn)一步利用 16S rDNA序列比較對生理生化鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。一般認(rèn)為,不同菌株16S rDNA序列的同源性高低與其親緣關(guān)系呈正相關(guān),同源性大于97.5%的菌株可視為同種[15-16],不過,也有 16S rDNA序列同源性大于97.5%的菌株卻屬于不同種的情況,如哈氏弧菌與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)(Genbank登錄號(hào)：EU660363)以及需鈉弧菌(V.natriegens)(Genbank 登錄號(hào)：EU660320)的 16S rDNA序列的同源性均在 98%以上,但卻屬于不同種。因

此,為提高細(xì)菌種類鑒定的準(zhǔn)確率,常常將生理生化指標(biāo)測定與 16S rDNA序列的同源性分析結(jié)合起來。作者綜合該2種方法的檢測結(jié)果,確定石斑魚脫鱗病的3株病原菌均為哈氏弧菌。

表2 菌株XC08061、XC08062、XC08063和哈氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的形態(tài)及生理生化特征Tab.2 Morphological,physiological and biochemical characteristics of strains XC08061、XC08062、XC08063 and standard strain of V.harveyi

圖3 以16S rDNA序列構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of Vibrio based on 16S rDNA genes

表3 不同濃度XC08061人工感染褐點(diǎn)石斑魚的累積死亡率Tab.3 The accumulated mortality rate of E.fuscoguttatus infected by different concentration of strain XC08061

表4 病原菌XC08061對25種抗菌藥物的敏感性Tab.4 The sensitivity of strain XC08061 to 25 chemotherapeutic agents

哈氏弧菌是一種常見的海洋生物致病菌,可導(dǎo)致多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物疾病,已報(bào)道的感染對象十分廣泛,包括大黃魚(Pseudosciaena crocea)等魚類[17]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)等蝦類[18]、文蛤(Meretrix meretrix)等貝類[19]以及刺參(Stichopus japonicus)等棘皮動(dòng)物[20]。該病原引起的疾病不僅死亡率高,而且發(fā)病迅速,感染后可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致感染動(dòng)物死亡[21];該病原引起疾病的癥狀也多種多樣,除常見的體表潰爛和充血等癥狀外,還可引起遮目魚(Chanos chanos)和斑節(jié)對蝦的爛眼[18,22],引起軍曹(Rachycentron canadum)的腸胃炎等[23]。作者對海南陵水褐點(diǎn)石斑魚脫鱗病的病原檢測結(jié)果表明其病原也是哈氏弧菌,該病發(fā)生后除有常見的體表潰瘍癥狀外,最顯著的癥狀為體側(cè)的鱗片成片脫落,并伴有爛鰭、肝脾腫大、腹腔積水乃至因膽囊破裂而致膽汁浸染體腔等癥狀,與已有報(bào)道存在一定的差異。褐點(diǎn)石斑魚脫鱗病發(fā)生后死亡速度快,人工感染實(shí)驗(yàn)表明,感染死亡的個(gè)體主要集中在感染后2 d以內(nèi),感染個(gè)體若3 d內(nèi)不死亡,則在15 d內(nèi)也全部成活,與 Estes等[21]報(bào)道的太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)幼蟲哈氏弧菌病相似。

LD50值是評(píng)價(jià)外源性物質(zhì)對受其影響的動(dòng)物的毒性大小的重要參數(shù),也是評(píng)價(jià)病原菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物危害性的主要指標(biāo)之一[24]。陳獻(xiàn)稿等[7]用哈氏弧菌腹腔注射感染斜帶石斑魚(E.coioides)所得的LD50值為2.7 × 106CFU/g魚體質(zhì)量;Liu等[23]用哈氏弧菌腹腔注射平均體質(zhì)量為 10 g的軍曹幼魚 LD50值為7.48 × 104CFU/g魚體質(zhì)量。作者所分離的哈氏弧菌菌株XC08061腹腔注射感染平均體質(zhì)量為32.5 g的褐點(diǎn)石斑魚所得LD50值僅為5.8 × 102CFU/g魚體質(zhì)量,低于陳獻(xiàn)稿等對斜帶石斑魚感染結(jié)果和Liu等對軍曹感染結(jié)果,說明該菌株對褐點(diǎn)石斑魚具有較強(qiáng)毒性。

對于養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的應(yīng)急治療,使用抗生素類藥物仍然是一種快速高效的手段[24]。本研究檢測了25種抗菌藥物病原菌XC08061的敏感性,結(jié)果只有新生霉素、頭孢噻肟、先鋒必/舒巴坦、諾氟沙星、依諾沙星和慶大霉素6種抗菌藥物對其敏感,說明該菌株存在較強(qiáng)耐藥性。在防治該病時(shí)可根據(jù)具體情況考慮選擇此6種藥物。不過,由于抗生素類藥物存在藥物殘留、耐藥性和污染環(huán)境等顯著缺陷,在水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害防治中即使是國家尚未列入禁用藥物清單的各類抗生素藥物,在使用后也必須嚴(yán)格執(zhí)行國家有關(guān)休藥期的有關(guān)規(guī)定,以保證食用水產(chǎn)品的安全。作者對病原菌XC08061的藥敏檢測結(jié)果與其他學(xué)者檢測的哈氏弧菌藥敏結(jié)果存在一定差異[20,25],說明哈氏弧菌的藥敏性可能因區(qū)域、菌株類型等的不同而存在差異。因此,在相關(guān)疾病防治時(shí)需要根據(jù)病原菌的具體情況選擇合適的種類,在使用前最好對病原菌株進(jìn)行藥敏檢測。

[1]廖經(jīng)球,尹紹武,陳國華,等.褐點(diǎn)石斑魚的核型研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2006,26(11)：567-569.

[2]黃劍南,林蠡,翁少萍,等.中國大亞灣赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒分離株的基因型分析[J].高技術(shù)通訊,2004,14(11)：75-80.

[3]楊霞,吳信中.赤點(diǎn)石斑魚的普通變形菌病原學(xué)研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(9)：5-7.

[4]陳曉燕,胡超群,陳償,等.人工養(yǎng)殖點(diǎn)帶石斑魚弧菌病病原菌的分離及鑒定[J].海洋科學(xué),2003,27(6)：68-72.

[5]Lee K K.Pathogeneis studies onVibrio alginolyticusin the grouper,Epinephelus malabaricusBloch et Schneider[J].Microb Pathog,1995,19(1)：39 - 48.

[6]Yii K C,Yang T I,Lee K K.Isolation and characterization ofVibrio carchariae,a causative agent of gastroenteritis in the groupers,Epinephelus coioides[J].Curr Microbiol,1997,35(2)：109-115.

[7]陳獻(xiàn)稿,吳淑勤,石存斌,等.斜帶石斑魚病原菌(哈維氏弧菌)的分離與鑒定[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2004,11(4)：313 -317.

[8]徐懷恕,楊學(xué)宋,李筠.對蝦苗期細(xì)菌病害的診斷與控制[M].北京：海洋出版社,1999：166 - 190.

[9]Mercedes A,Anicent R B.A set of keys for biochemical identification of environmentalVibriospecies[J].Journal of Applied Bacteriology,1994,76：78-85.

[10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社,2001：353-381.

[11]薩姆布魯克 J,D W 拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].北京：科學(xué)出版社,2003：87 - 99.

[12]Bliss C I.The determination of the dosage-mortality curve from small numbers[J].Quart J Pharm and Pharmacol,1938,11：192-216.

[13]WS/T 125-1999,紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1999.

[14]Noguerola I,Blanch A R.Identification ofVibriospp.with a set of dichotomous keys[J].J Appl Microbiol,2008,105：175-185.

[15]Thompson F L,Iida T,Swings J.Biodiversity of vibrios[J].Microbiol Mol Biol Rev,2004,68：403-431.

[16]蹇文嬰,東秀珠.定向進(jìn)化同源基因在細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2000,27(5)：377-381.

[17]石亞素,童國忠,薛超波,等.舟山養(yǎng)殖大黃魚爛尾病中哈氏弧菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(3)：267-269.

[18]Lee K K,Chen Y L,Liu P C.Hemostasis of tiger prawnPenaeus monodonaffected byVibrio harveyi,extracellular products and a toxic cysteine protease[J].Blood Cells,Molecules and Diseases,1999,25(13)：180-192.

[19]劉連生,閆茂倉,林志華,等.引起文蛤暴發(fā)性死亡病原菌的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào),2009,36(1)：71-77.

[20]楊嘉龍,周麗,繩秀珍,等.養(yǎng)殖刺參潰瘍病病原菌RH2 的鑒定及其生物學(xué)特性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007,31(4)：504-511.

[21]Estes R M,Friedman C S,Elston R A,et al.Pathogenicity testing of shellfish hatchery bacterial isolates on Pacific oysterCrassostrea gigaslarvae[J].Dis Aquat Organ,2004,58：223-230.

[22]Ishimaru K,Muroga K.Taxonomical re-evaluation of two pathogenicVibriospecies isolated from milkfish and swimming crab[J].Fish Pathol,1997,32：59-64.

[23]Liu P C,Lin J Y,Chuang W H,et al.Isolation and characterization of pathogenicVibrio harveyi(V.carchariae)from the farmed marine cobia fishRachycentron canadumL with gastroenteritis syndrome[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2004,20：495 - 499.

[24]楊寧,謝珍玉,黃紀(jì)徽,等.海南養(yǎng)殖的奧尼羅非魚暴發(fā)性出血癥病原的分離與鑒定[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,27(1)：43-47.

[25]王斌,于蘭萍,胡亮,等.紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2008,15(2)：352-358.