(煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

紫蛇尾(Ophiopholis mirabilis),屬于棘皮動物門(Echinodermata),蛇尾綱(Ophiuroidea),顎蛇尾亞目(Gnathophiurina),輻蛇尾科(Ophiactidae),紫蛇尾屬(OphiopholisMuller et Troschel),在黃海中部和北部,大連,旅順,海洋島,長島,煙臺和青島外海大量分布[1]。據(jù)報道,已從棘皮動物門海星綱、海參綱多個科屬中提取分離得到具有降血壓、抗腫瘤、抗真菌、抗炎和抗糖尿病作用等生理功能的皂苷類化合物[2-6],但對蛇尾綱動物皂苷的研究未見報道。目前測定皂苷含量的主要方法有溶血指數(shù)法、香草醛-高氯酸比色法、高效液相色譜法等,而紫蛇尾皂苷經(jīng)過顏色反應(yīng)鑒定為甾體皂苷,可以參照文鎮(zhèn)等測定甾體海星皂苷的實驗方法進(jìn)行測定[7]。

本研究首次從黃渤海交匯處長島海域的紫蛇尾(整體)中提取皂苷并確定檢測方法和最佳提取工藝,為紫蛇尾皂苷進(jìn)一步制備、純化研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

紫蛇尾,2009年4月采集于黃渤海交匯處的長島海域,洗凈泥沙后自然風(fēng)干、粉粹,備用。Rotavapor R-220(BUCHI);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司);TU1900紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅公司)。標(biāo)準(zhǔn)皂苷(Serva進(jìn)口分裝,北京化工廠),甲醇、乙醇、濃硫酸等均為分析純。

2 方法

2.1 紫蛇尾皂苷檢測波長確定

自制皂苷樣品配成 0.50 g/L的甲醇溶液,取 1 mL溶液于10 mL比色管中,揮干溶劑,加入2 mL濃硫酸,60 ℃水浴顯色60 min,冰水浴冷卻,用甲醇定容至10 mL比色管,200～800 nm掃描波長,20%硫酸-甲醇(H2SO4:CH3OH = 1:4,V/V)溶液隨行空白,標(biāo)準(zhǔn)皂苷做對比。通過掃描,在276 nm處有最大吸收峰。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密移取標(biāo)準(zhǔn)皂苷甲醇溶液(1.067 g/L)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管中,揮干溶劑,加入2.0 mL濃硫酸,60℃水浴鍋顯色反應(yīng)60 min,冰水浴冷卻,將甲醇定容至10 mL比色管并混勻、冷卻,20%硫酸-甲醇溶液隨行空白,在276 nm處測定吸收值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 單因素實驗

紫蛇尾皂苷采用傳統(tǒng)溶劑法提取,影響皂苷提取產(chǎn)率的因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比5個因素。通過單因素實驗分析 5個因素對紫蛇尾皂苷提取的影響力大小以及各主要影響因素的水平。以溫度因素為例,流程如下:

取紫蛇尾樣品10.00 g于燒杯中,加入85%乙醇200 mL,30 ℃(或者 40、50、60、70 ℃)水浴加熱提取 3 h,合并上清液并過濾,將濾液減壓蒸干,用甲醇溶解后定容至100 mL容量瓶。取0.2 mL置于10 mL比色管中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線做法測定276 nm處吸光度,空白對照也同標(biāo)準(zhǔn)曲線做法。做出溫度對吸光度變化曲線圖。

表1 因素及水平Tab.1 Factors and levels

2.4 正交實驗

通過單因素實驗,確定影響紫蛇尾皂苷提取產(chǎn)率的四個主要因素以及各因素的三個水平。采用L9(34)正交實驗法確定最佳提取工藝。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程:y=1.4017x- 0.0162,R2 = 0.9986

圖1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Curve of standard saponin

3.2 單因素實驗結(jié)果

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

由圖2看出,乙醇體積分?jǐn)?shù) 85%時吸光度最大,也即皂苷產(chǎn)率最大,而體積分?jǐn)?shù)小于 85%或者大于85%時吸光度減小,同時考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)減小會從樣品中溶解更多的無機(jī)鹽、糖類等雜質(zhì),對后續(xù)分離純化工作增加難度,出于綜合考慮,選擇體積分?jǐn)?shù) 85%乙醇作為提取溶劑。這與本項目組以前研究中提取砂海星皂苷、海燕皂苷時所用的乙醇體積分?jǐn)?shù)相同[8]。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對吸光度影響Fig.2 Influence of ethanol concentration on the absorbance

3.2.2 提取溫度的影響

圖3表明,在溫度50℃時,皂苷產(chǎn)率最大,超過50℃產(chǎn)率開始下降,在保證產(chǎn)率的前提下,為減少乙醇揮發(fā),確定溫度的三個水平為 40℃,50℃和60℃。

3.2.3 提取時間的影響

圖4可以看出,隨著時間延長吸光度呈增加趨勢,4 h后趨于平緩,因此選擇2,3,4 h作為提取時間的三個水平。

圖3 溫度對吸光度影響Fig.3 Influence of temperature on the absorbance

圖4 提取時間對吸光度影響Fig.4 Influence of extraction time on the absorbance

3.2.4 提取次數(shù)的影響

隨著提取次數(shù)增加,吸光度增大,但是第4次、第5次增加趨于平緩,從綜合減小能耗角度考慮,選擇2次、3次、4次作為三個水平(圖5)。

圖5 提取次數(shù)對吸光度影響Fig.5 Influence of extraction times on the absorbance

3.2.5 料液比的影響

圖6所示,隨著料液比增加,吸光度呈增加趨勢,料液比1:50 (W/V)與1:40 (W/V)變化不大,因此選擇料液比1:20(W/V),1:30(W/V),1:40 (W/V)作為三個水平。

綜上結(jié)果,選擇提取溫度(40,50,60℃),提取次數(shù)(2,3,4次),提取時間(2,3,4 h),料液比[1:20(W/V),1:30 (W/V),1:40 (W/V)],作為正交實驗的因素及水平。

圖6 料液比對吸光度影響Fig.6 Influence of solid to liquid ratio on the absorbance

3.3 正交實驗結(jié)果

正交實驗表及各組實驗的皂苷產(chǎn)率如表2所示,對結(jié)果進(jìn)行極差分析,可以看出A因素(提取溫度)極差最大,C因素(提取時間)極差最小,也即影響紫蛇尾皂苷提取工藝的因素大小為:提取溫度 ＞ 料液比 ＞ 提取次數(shù) ＞ 提取時間。根據(jù)極差分析,得到紫蛇尾皂苷提取的最佳工藝條件是A3B3C2D3,即60℃水浴,料液比1:40 (W/V),提取4次,每次3 h。按照最佳工藝條件重復(fù)提取三組,所得平均產(chǎn)率為1.77‰。

3.4 多元線性回歸模型(MLR)的建立

對于正交實驗確定的自變量(Xi)和相應(yīng)的因變量(Y),通過SPSS軟件進(jìn)行逐步回歸,建立紫蛇尾皂苷產(chǎn)率和相關(guān)影響因素之間的線性模型:y=1.279+0.007T+0.053N+0.005t-4.943r

公式中:T為提取溫度,N為提取次數(shù),t為提取時間,r為料液比。該模型的R2=0.914,F=10.585,說明紫蛇尾皂苷的產(chǎn)率和提取工藝相關(guān)因素有顯著的相關(guān)關(guān)系。

為了檢驗該回歸模型的合理性,用正交實驗中的 2號和 8號進(jìn)行預(yù)測,并將預(yù)測值與實驗值比較,如表3所示,該模型預(yù)測能力較好,可以用于紫蛇尾皂苷產(chǎn)率的預(yù)判,為蛇尾皂苷提取工藝的相關(guān)因素的選擇提供依據(jù)。

4 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗,首次確定紫蛇尾皂苷的最佳提取工藝為 60℃水浴,料液比 1 :40(W/V),每次3 h,提取4次,并且建立了紫蛇尾皂苷產(chǎn)率和相關(guān)影響因素之間的多元線性回歸模型。這為紫蛇尾皂苷后續(xù)的制備、純化提供了基礎(chǔ),為海蛇尾資源的開發(fā)利用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

表2 正交實驗結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal experiments

表3 MLR模型預(yù)測結(jié)果Tab.3 The predicted results of the MLR model

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