付 薇，吳佳海，陳 偉，王小利，牟 瓊

(貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

高羊茅(Festucaarundinacea)是禾本科羊茅屬的一種多年生草本植物，它可用作長(zhǎng)期放牧草地的優(yōu)良牧草，經(jīng)過(guò)選育后，高羊茅也是適應(yīng)性很廣的優(yōu)良草坪草種[1]。貴州省草業(yè)研究所經(jīng)過(guò)多年的田間尋找，于1998年6月在該所試驗(yàn)駐地發(fā)現(xiàn)了一株高羊茅雄性不育植株，現(xiàn)處于鑒定初期[2]。目前，國(guó)內(nèi)雄性不育系的研究報(bào)道多見于作物品種[3-5]，牧草及草坪草雄性不育的研究利用相對(duì)較少。國(guó)外，法國(guó)已把黑麥草(Loliumperenne)的雄性不育系用于生產(chǎn)，加拿大選育出苜蓿(Medicagosativa)雄性不育系20DRE。對(duì)三葉草(Trifoliumrepens)、蘇丹草(Sorghumsudanense)的雄性不育也有一些研究[6]，但高羊茅雄性不育系的發(fā)現(xiàn)及利用至今未見報(bào)道。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)高羊茅的研究主要集中在良種選育[7]、引種適應(yīng)性[8]、栽培技術(shù)[9-10]、愈傷組織培養(yǎng)[11]、分子標(biāo)記[12]等方面。有關(guān)高羊茅細(xì)胞學(xué)的研究較少，僅見于蔡華等[13]、白宇輝和陳陽(yáng)莉[14]對(duì)高羊茅核型分析報(bào)道，而針對(duì)雄性不育植株的研究更為鮮見。因此，本試驗(yàn)以貴州省草業(yè)研究所發(fā)現(xiàn)的高羊茅雄性不育株(編號(hào)A072003)為材料，采用卡寶品紅染色制片法，對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程及異常行為進(jìn)行較為細(xì)致的觀察，以期揭示高羊茅不育材料花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體變化的行為規(guī)律，尋找高羊茅花粉敗育的細(xì)胞學(xué)依據(jù)，豐富高羊茅的細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容，為高羊茅發(fā)育生物學(xué)及小孢子敗育等方面提供必要的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，為利用高羊茅雄性不育株開展雜交育種工作，選育一批適用于草坪及飼草兼水保功能的優(yōu)良品種奠定理論基礎(chǔ)，也為高羊茅發(fā)育生物學(xué)和育種學(xué)提供必要的細(xì)胞遺傳學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1材料 以貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山基地內(nèi)種植的高羊茅雄性不育植株(編號(hào)A072003)為試材，選取抽穗初期的高羊茅花序進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2方法 于2011年5月上旬，采用連續(xù)取材觀察的方法于早晨9:00至中午12:30，選取生長(zhǎng)健康的高羊茅幼穗，用卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇∶冰乙酸體積比為3∶1)于室溫下固定3 h后，用95%的乙醇清洗3次，轉(zhuǎn)入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存。采用壓片法制取減數(shù)分裂制片。用鑷子夾取花藥，將其置于載玻片上，加1滴卡寶品紅進(jìn)行染色，然后用鑷子夾破(花粉囊)，擠出花粉母細(xì)胞，并盡可能地將其夾碎，去殘?jiān)?，染?～3 min后，加蓋玻片并緊壓，使花粉母細(xì)胞進(jìn)一步分散，用吸水紙吸去多余的染色劑后于日本OLYMPUS公司BH-2型多功能光學(xué)顯微鏡下鏡檢，放大倍數(shù)為40×10倍，并用Adobe Photoshop 7.0對(duì)圖片的亮度和對(duì)比度進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂與花蕾形態(tài)特征相關(guān)性 高羊茅每朵小花具有3枚花藥，通過(guò)取樣觀察，發(fā)現(xiàn)A072003材料的花粉母細(xì)胞的發(fā)育程度與小花大小、花藥長(zhǎng)度、花藥顏色緊密相關(guān)，處于減數(shù)分裂期的小花縱徑為0.05～0.07 cm，花藥長(zhǎng)度為0.07～0.18 cm，此間大小的小花能夠觀察到花粉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期(表1)。

2.2高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為觀察 通過(guò)卡諾液固定、 卡寶品紅染色、 壓片及鏡檢等操作，本試驗(yàn)觀察到了部分高羊茅在減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的一系列行為變化特征。

表1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程與花器官形態(tài)比較

2.2.1第1次減數(shù)分裂 減數(shù)分裂的細(xì)線期，細(xì)胞核內(nèi)的染色體細(xì)長(zhǎng)如線，核仁處于核膜附近，在這一時(shí)期染色體相互纏繞，密集簇?fù)淼胶说囊贿?圖1A)。偶線期，細(xì)胞核內(nèi)同源染色體聯(lián)會(huì)，染色體開始逐步的分散開，較之于細(xì)線期略微變短、增粗，但顏色較淺，顯微鏡下無(wú)法辨認(rèn)染色單體(圖1B)。此時(shí)，由于同源染色體的聯(lián)會(huì)配對(duì)，染色體繼續(xù)螺旋化變短加粗，顏色加深，減數(shù)分裂進(jìn)入粗線期 (圖1C)。雙線期，染色體進(jìn)一步螺旋化縮短變粗，配對(duì)的同源染色體彼此排斥并開始分離，但不完全分開，發(fā)生過(guò)交換的部位仍連在一起，形成交叉結(jié)，并能觀察棒狀、環(huán)狀和V狀二價(jià)體(圖1D)。當(dāng)減數(shù)分裂進(jìn)行至終變期，染色體超螺旋化，二價(jià)體縮至最短，呈現(xiàn)出“紐扣狀”形態(tài)，染色體向核周邊移動(dòng)，均勻分散排列于細(xì)胞核內(nèi)，核仁變小并逐步消失(圖1E)。中期Ⅰ時(shí)，核膜、核仁消失，紡錘體形成，染色體高度凝縮，二價(jià)體整齊地聚集在赤道板上，行為特征主要表現(xiàn)為“環(huán)形”和“重疊型”(圖1F)。后期Ⅰ，二價(jià)體中的2條同源染色體在紡錘絲的牽引下彼此分開并向兩極移動(dòng)，此時(shí)父母本染色體得以重組 (圖1G)。末期Ⅰ染色體移到兩極后松散變細(xì)，逐漸形成2個(gè)子核，但細(xì)胞質(zhì)不分裂(圖1H)。

2.2.2第2次減數(shù)分裂 高羊茅花粉母細(xì)胞在第1次減數(shù)分裂完畢之后，細(xì)胞核沒(méi)有DNA復(fù)制，染色質(zhì)在很短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)螺旋化縮短、變粗，進(jìn)入前期Ⅱ時(shí)期(圖1I)。到了中期Ⅱ，染色體顯著縮短，每個(gè)染色體的著絲點(diǎn)排列在赤道板上面，紡錘絲中部明顯(圖1J)。后期Ⅱ可觀察到著絲粒一分為二，位于赤道板上的姐妹染色單體在各自紡錘絲的牽引下向細(xì)胞兩極移動(dòng)(圖1K)。末期Ⅱ染色體被拉向兩極，紡錘絲消失，核膜、核仁出現(xiàn)，染色體又變細(xì)長(zhǎng)，形成4個(gè)圓形的新核(圖1L)。此時(shí)核周圍形成細(xì)胞壁，4個(gè)子細(xì)胞緊密相連發(fā)育成四分體小孢子(圖1M)。四分體初期細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞壁不明顯，以后體積慢慢變大，發(fā)育為成熟游離花粉粒。

2.3高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂周期不同步現(xiàn)象 高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，存在著一定程度的非同步性分裂現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在，高羊茅同一花序的不同小花內(nèi)、同一朵小花的不同花藥內(nèi)，更甚是同一花藥內(nèi)都存在減數(shù)分裂時(shí)期不同步的現(xiàn)象，制片中可同時(shí)觀察到不同減數(shù)分裂時(shí)期并存的現(xiàn)象(如：后期Ⅱ、末期Ⅱ、四分體時(shí)期并存，末期Ⅰ、前期Ⅱ并存)(圖1N、圖1O)。因此，在高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的同一制片中可觀察到大量2～4個(gè)不同時(shí)期的分裂相。

圖1 高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程及分裂不同步性

2.4高羊茅花粉母細(xì)胞分裂異常行為 高羊茅雄性不育材料的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程大量存在單價(jià)體、染色體橋、落后染色體、微核、不同步分裂等異?，F(xiàn)象，減數(shù)分裂產(chǎn)物有三分體(圖2A)，中期Ⅱ可觀察到少量呈60°角的紡錘體(圖2B)。

2.4.1單價(jià)體 在減數(shù)分裂的終變期，大量花粉母細(xì)胞存在因沒(méi)有同源染色體而不能聯(lián)會(huì)的單價(jià)體，這些單價(jià)體因不配對(duì)常呈棒狀或彎曲成V形而獨(dú)立于赤道板之外(圖2C)，有時(shí)其自身的兩臂也會(huì)配對(duì)發(fā)生交叉而成環(huán)狀(圖2D)。

2.4.2染色體橋和片段 在減數(shù)分裂中，正常的染色體同倒位染色體之間發(fā)生交叉互換，會(huì)使配子染色體上某一區(qū)段缺失或重復(fù)，兩條同源染色體無(wú)法直線配對(duì)，而是以一個(gè)圓圈完成同源部分的配對(duì)，這個(gè)由兩條同源染色體形成的圈被稱作倒位環(huán)。一個(gè)倒位雜合體如果著絲粒在倒位環(huán)的外面，則在減數(shù)分裂后期會(huì)出現(xiàn)“染色體橋”(圖2E)和“片段”(圖2F)的現(xiàn)象，即一條染色單體的兩端都有一個(gè)著絲粒，成為跨越兩端的“橋”，同時(shí)伴隨一個(gè)沒(méi)有著絲粒的斷片。染色體橋在染色體移向兩極進(jìn)入子細(xì)胞時(shí)被拉斷，造成很大缺失，而染色體斷片則不能進(jìn)入子細(xì)胞的核內(nèi)，所以由此形成的配子往往是死亡的。

2.4.3落后染色體 花粉母細(xì)胞在分裂過(guò)程中受到損傷，導(dǎo)致染色體不同步移動(dòng)或者不移動(dòng)形成落后染色體，這一異常分裂現(xiàn)象在減數(shù)分裂中期Ⅰ，后期Ⅰ，后期Ⅱ和末期Ⅱ都有發(fā)現(xiàn)(圖2G、2H、2I、2J)，減數(shù)分裂過(guò)程單價(jià)體及落后染色體的存在證明了高羊茅雄性不育株的基因組具有較強(qiáng)的雜合性。

2.4.4不同步分裂 高羊茅不育材料中有少數(shù)花粉母細(xì)胞由于紡錘絲異常，2個(gè)子細(xì)胞在分裂時(shí)不伴隨胞質(zhì)同步分裂而成，如2個(gè)子細(xì)胞中，其中一個(gè)子細(xì)胞的染色體正在紡錘絲牽引下向兩極移動(dòng)，而另外一個(gè)子細(xì)胞的染色體已經(jīng)全部聚集在兩極(圖2K、圖2L)。

2.4.5微核 微核主要是由染色體斷片、落后染色體引起的，發(fā)生斷裂或滯后的染色體不能隨紡錘絲的牽引進(jìn)入兩極，或滯留于赤道板上，或隨機(jī)分布在主核之外，逐漸形成直徑小于主核的圓形或橢圓形微小核，一直到末期Ⅱ再形成微核，這類細(xì)胞形成的配子部分不育。該異?，F(xiàn)象在中期Ⅱ、前期Ⅰ、四分體時(shí)期比較常見(圖2M，2N，2O)。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中，高羊茅減數(shù)分裂進(jìn)程與小花大小、花藥長(zhǎng)度、顏色有密切關(guān)系，通過(guò)分析花器官形態(tài)特征與減數(shù)分裂進(jìn)程的相關(guān)性，并充分利用這種相關(guān)性估測(cè)減數(shù)分裂進(jìn)程可取得事半功倍的效果。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高羊茅不育株A072003處于減數(shù)分裂期時(shí)的小花縱徑為0.05～0.07 cm，花藥長(zhǎng)度為0.07～0.18 cm，此間大小的小花能夠觀察到花粉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期。以花藥長(zhǎng)度、顏色作為減數(shù)分裂進(jìn)程、花粉粒成熟度的主要判斷依據(jù)，比較簡(jiǎn)便、直觀。不過(guò)，由于高羊茅穗子發(fā)育與播種時(shí)間、土壤環(huán)境、氣候條件等密切相關(guān)，因此以小花、花藥大小、色澤作為采樣依據(jù)，本研究只是一種探索總結(jié)，是否適用于其他高羊茅不育材料還有待進(jìn)一步證實(shí)。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程存在著一定程度的非同步性分裂現(xiàn)象，同一花序的不同小花內(nèi)、同一朵小花的不同花藥內(nèi)，更甚是同一花藥內(nèi)都存在減數(shù)分裂時(shí)期不同步的現(xiàn)象。因此，在高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的同一制片中可觀察到2～4個(gè)不同時(shí)期的分裂，這一不同步現(xiàn)象在辛培堯等[15]、張偉等[16]、張彩霞等[17]研究中都有報(bào)道。王君等[18]在觀察通遼楊(PopulussimoniiCarr×P.nigraL.‘Tongliao’)減數(shù)分裂染色體行為過(guò)程中也曾指出，各個(gè)分裂相的不同步性可以起到延長(zhǎng)花期的作用，也有利于增加兩性功能，對(duì)種群繁殖后代有利，是植物適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件的一種進(jìn)化表現(xiàn)。田如霞等[19]在研究錦雞兒(Caraganamicrophylla)花粉母細(xì)胞染色體行為中也表明，減數(shù)分裂的不同步現(xiàn)象反映出異花授粉植物的同步性比自花授粉植物低的一般規(guī)律。

本研究發(fā)現(xiàn)了染色體橋、片段、落后染色體、微核、不均分離等異?，F(xiàn)象。其中落后染色體的頻率最高，在中期Ⅰ、后期Ⅱ、中期Ⅲ、后期Ⅳ 4個(gè)時(shí)期中均能發(fā)現(xiàn)，可能是由于某些染色體同源化程度不高導(dǎo)致的。而往往花粉的育性與花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程緊密相關(guān)，高羊茅雄性不育材料花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中出現(xiàn)了大量的染色體橋和片段，而在分裂后期Ⅰ這些染色單體橋在倒位環(huán)內(nèi)只有一次交換，涉及2條染色單體產(chǎn)生的配子50%可育，當(dāng)別的染色體分向兩極時(shí)，橋也拉長(zhǎng)，一直到拉斷形成染色體斷片為止。這一觀察同何麗霞[20]在黃牡丹(Paeonialutea)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程當(dāng)中及栗茂騰和蔡和田[21]在披堿草減數(shù)分裂中所發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相似。潘澤惠等[21]在觀察傘形科植物減數(shù)分裂時(shí)認(rèn)為，一些種類的染色體發(fā)生雜合性結(jié)構(gòu)差異，致使減數(shù)分裂時(shí)產(chǎn)生雙著絲點(diǎn)染色體，在后期Ⅰ形成染色體橋和斷片。后期Ⅰ染色體橋是一種不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在以后的細(xì)胞分裂過(guò)程中將開始“斷裂-融合一橋”循環(huán)，致使這條染色體從細(xì)胞中丟失，結(jié)果導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的減少。此外，由于落后染色體和染色體橋造成了染色體的不均勻分配，導(dǎo)致了減數(shù)分裂的一些異常結(jié)果，形成有遺傳組成不平衡的配子，產(chǎn)生不同遺傳組成的花粉粒。以上都是導(dǎo)致高羊茅花粉敗育的重要原因之一。本研究還在終變期發(fā)現(xiàn)了大量的單價(jià)體，有棒狀、V狀、環(huán)狀單價(jià)體，這種環(huán)狀單價(jià)體在小麥(Triticumaestivum)中已有報(bào)道，李萬(wàn)隆和李振聲[23]指出環(huán)狀單價(jià)體的研究對(duì)染色體特異性配對(duì)等基本理論問(wèn)題有重要的意義。張正海等[24]在小胡楊(Populussimonii×P.euphratica)染色體行為觀察中指出，小胡楊二分體和三分體的形成是由于中期Ⅱ紡錘體的合并以及減數(shù)第2次分裂的不同步所造成的，紡錘體行為影響著減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂，從而導(dǎo)致二分體、三分體等不同構(gòu)型的減數(shù)分裂產(chǎn)物出現(xiàn)。由此分析，本試驗(yàn)第2次減數(shù)分裂過(guò)程中觀察到的三分體，可能同中期Ⅱ中發(fā)現(xiàn)的60°角紡錘體有關(guān)。三分體、二分體或包含微小孢子的二分體釋放出的小孢子可能將形成未減數(shù)分裂花粉，導(dǎo)致敗育。

圖2 高羊茅花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象觀察

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