李 晶，任衛(wèi)波，郭慧琴，王茅雁，劉雅學(xué)

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

硒是維持植物正常生理機(jī)能必需的微量元素之一[1]。在生物體內(nèi)，硒主要參與合成硒蛋白，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的必要成分。適量的硒對維持GSH-Px酶活性，提高機(jī)體抗氧化能力具有重要作用[2]。然而，過量的硒能夠?qū)χ参锛?xì)胞產(chǎn)生毒害作用，主要?dú)w因于在含硫蛋白質(zhì)或酶中，硒能夠替代硫元素，從而導(dǎo)致該蛋白失去活性。

我國是一個貧硒的國家，劉金旭等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國近72%的草原區(qū)生產(chǎn)的牧草平均硒含量低于0.05 mg·kg-1，屬于缺硒牧草，不能滿足家畜生長對硒的需求。研究表明，飼用高硒苜蓿干草(硒含量是普通干草的8～10倍)后，奶牛體長、胸圍和體質(zhì)量顯著增加，日產(chǎn)奶量提高8.6%，奶料比降低12.17%，乳脂含量提高22.15%[4]。通過遺傳改良培養(yǎng)富硒苜蓿是提高苜蓿干草硒含量最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。

硒超富集植物二溝黃芪(Astragalusbisulcatus)在野生條件下，其莖葉中硒含量占到干質(zhì)量的0.65%[5]，是理想的富硒基因來源。從該植物中能克隆到富硒/耐硒基因smt1(硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因)。Ellis等[5]將該基因轉(zhuǎn)移到擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，獲得超表達(dá)smt1基因的轉(zhuǎn)基因植株，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株硒含量增加了6～8倍。因此，二溝黃芪smt1基因是利用遺傳改良方法培育富硒苜蓿的首選。然而，目前國內(nèi)有關(guān)二溝黃芪smt1基因在紫花苜蓿(Medicagosativa)中的遺傳轉(zhuǎn)化及超表達(dá)的相關(guān)研究較少。為此，本研究以國內(nèi)廣泛種植的紫花苜蓿品種“中苜1號”植株為受體材料，通過構(gòu)建表達(dá)載體及農(nóng)桿菌侵染，以期獲得超表達(dá)smt1基因的轉(zhuǎn)化植株，為富硒苜蓿新品種選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1受體材料 選取顆粒飽滿的“中苜1號”種子(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川老師提供)，經(jīng)75%酒精浸泡1 min后，放入次氯酸鈉浸泡10～20 min，然后用蒸餾水沖洗3～4次，將沖洗干凈的種子放在濾紙上吸干，接種于固體培養(yǎng)基中(pH值6.0)。培養(yǎng)條件為25 ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光/暗周期16 h/8 h，培養(yǎng)6～7 d，取苜蓿無菌苗的下胚軸，作為轉(zhuǎn)化受體。

1.1.2smt1基因cDNA序列合成 二溝黃芪smt1基因cDNA序列信息從中NCBI獲取，cDNA片段由大連寶生物TAKARA公司合成，合成后cDNA片段連接到克隆T載體，并轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1表達(dá)載體的構(gòu)建 分別提取含有smt1基因cDNA片段的重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pCAMBIA1301的質(zhì)粒。隨后用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切。酶切后，用DNA膠回收試劑盒分別回收pCAMBIA1301的大片段和重組克隆質(zhì)粒的小片段，并去磷酸化，按照連接試劑盒的操作步驟進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒，隨后利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇1 h，均勻涂在加有卡納霉素(Kan)的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，進(jìn)行檢測(圖1)。

圖1 質(zhì)粒pCAMBIA1301圖譜Fig.1 Construction of expression vector pCAMBIA1301-Absmt1

1.2.2農(nóng)稈菌工程菌制備及檢測 用北京天根公司生產(chǎn)的質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，選取EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，酶切體系如下：重組質(zhì)粒5 μL，EcoR I和BamH I各1 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 9 μL，置于37 ℃培養(yǎng)2 h，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。利用熱激法將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。 隨機(jī)挑取4個轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。 20 μL PCR反應(yīng)體系包括10×PCR Buffer 1.5 μL，TransStart Taq (5 U·μL-1) 0.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 1.3 μL，引物(10 μmol·L-1)0.3 μL,菌液1 μL，ddH2O加至總體積20 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min,共35循環(huán)，72 ℃終止反應(yīng)10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增引物序列：

P1:5′-ACATGATTACGAATTCATGTCGTC-GCCATTGATAAC-3′;

P2:5′-CGACTCTAGAGGATCCCTTTGCAG-AAAAAGTAGG-3′。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

1.3.1菌液的制備 挑取單菌落加入含有50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1利福平(Rif)液體LB培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床中200 r·min-1培養(yǎng)12 h，當(dāng)菌液OD值為0.5時停止培養(yǎng)。在超凈工作臺上吸取5 mL該菌液，加入無抗生素LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃復(fù)蘇1 h，離心富集菌體用于侵染。

1.3.2外植體的轉(zhuǎn)化、繼代和轉(zhuǎn)化植株的獲得 將生長6～7 d的無菌苗,用解剖刀將下胚軸切成3～4 mm 的小段,接種到預(yù)培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 d。取預(yù)培養(yǎng)的下胚軸浸泡已加入乙酰丁香酮(50 μmol·L-1)的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕搖動使下胚軸和農(nóng)桿菌充分接觸，處理5 min后，取出下胚軸，并用滅菌濾紙吸干表面菌液，置于共培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)2 d。用1/2 MS液體培養(yǎng)基中加入頭孢霉素(100 mg·L-1)浸泡下胚軸5 min，用濾紙吸干表面液體置于篩選培養(yǎng)上，15 d繼代一次，待愈傷完全形成后置于分化培養(yǎng)基中，15 d繼代一次。待植株形成后放入1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)獲得完整轉(zhuǎn)化植株，將植株移植到含有營養(yǎng)液的蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4潮霉素抗性的篩選 外植體切取后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周。隨后，將其轉(zhuǎn)入含有不同梯度潮霉素(Hyg)的篩選培養(yǎng)基中，15 d更換一次培養(yǎng)基，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時間16 h。共設(shè)置0、3、6、9、12 mg·L-15個潮霉素梯度進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的篩選，每個梯度選取50個外植體，對誘導(dǎo)分化的外植體誘導(dǎo)率、褐化情況進(jìn)行觀測，確定最佳的篩選壓條件。

1.5轉(zhuǎn)基因植株檢測 在獲得的10個轉(zhuǎn)化單株中，選取長勢較好的5個單株，用植物基因組DNA提取試劑盒單株提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。隨后用植物RNA提取試劑盒單株提取RNA，用Transgene反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transascrit Ⅱ First-strand cDNA synthesis Supermix)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系包括RNA 50～500 ng、2×TSII Reaction Mix 1 μL、TranaScrit Ⅱ RT Enzyme Mix 1 μL、 Rnase-free Water加到20 μL。 然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)循環(huán)包括94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延長2 min，共40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延長10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌酶切檢測 表達(dá)載體pCAMBIA1301-smt1經(jīng)過雙酶切，形成一大一小2個片段(圖2)，其中小片段在1 000 bp左右，與smt1基因的cDNA片段大小吻合，這表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。菌落PCR檢測結(jié)果表明，隨機(jī)選取的4個轉(zhuǎn)化菌落均擴(kuò)增獲得1 000 bp左右的片段，這表明4個菌落均為陽性重組質(zhì)粒(圖3)。

2.2潮霉素抗性篩選 潮霉素對苜蓿愈傷組織的形成有顯著的抑制效應(yīng)。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度達(dá)到6 mg·L-1時，與未添加潮霉素相比，出愈率降低近90%。與此同時，隨著潮霉素質(zhì)量濃度的增加，玻璃化、褐化現(xiàn)象逐步嚴(yán)重，當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為9和12 mg·L-1時，外植體全部出現(xiàn)褐化、玻璃化。因此，3 mg·L-1是潮霉素抗性篩選的最佳質(zhì)量濃度。

2.3轉(zhuǎn)化植株檢測 基因組PCR檢測結(jié)果表明，供試的10個轉(zhuǎn)化植株中有5株能擴(kuò)增出1 000 bp大小的特征條帶，該條帶與目的基因大小相符，初步表明目的基因已整合到紫花苜?；蚪M中(圖4)。RT-PCR檢測結(jié)果表明，5個轉(zhuǎn)基因植株中的2株基因表達(dá)呈陽性，擴(kuò)增出了與目的基因cDNA大小一致的片段，其他3個單株均未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖5)。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmid

圖3 單菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定Fig.3 PCR analysis of single colony of agrobacterium with recombinant plasmid

表1 不同濃度潮霉素對苜蓿愈傷組織形成的影響 Table 1 Effects of hygromycin concentration on formation of alfalfa callus

圖4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測鑒定Fig.4 PCR analysis of transgenic plants

圖5 轉(zhuǎn)化植株基因表達(dá)鑒定Fig.5 RT-PCR analysis of transgenic plants

3 討論

硒作為重要的微量元素，不僅對苜蓿正常生長及其抗逆能力的提高具有重要作用，還可通過食物鏈，增加人類膳食中硒的水平，增強(qiáng)其抗癌能力[6]。然而，由于我國土壤中硒水平普遍比較低，要提高苜蓿飼草中硒水平，一方面要通過增施硒肥，提高硒供給水平，另一方面要通過遺傳改良，培育富硒苜蓿品種。已有的研究[7]表明，增施硒肥雖然可以部分彌補(bǔ)硒缺乏，提高飼草產(chǎn)量和硒含量，但硒利用效率低，需要大量投入硒肥，這不僅成本高，而且容易造成土壤硒污染。因此,通過遺傳改良，培育富硒新品種是經(jīng)濟(jì)、安全的提高硒含量的方法。

自然中存在一些硒超富集植物，二溝黃芪就是其中之一。Sors等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤硒含量為2.2 μg·g-1時，二溝黃芪莖葉硒可達(dá)94.4～96.3 μg·g-1，花序中硒質(zhì)量濃度可達(dá)308.9～312.9 μg·g-1,其質(zhì)量濃度是相同生境下其他黃芪屬植物的30～100倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二溝黃芪之所以能夠超富集硒而不受硒毒害的影響，原因在于其體內(nèi)的硒半胱氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(SMT,Selenocysteine Methytransferase)能將大部分硒代半胱氨酸(SeCys)高效轉(zhuǎn)化為無毒害的硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys，Se-methylselenocysteine)。最新研究發(fā)現(xiàn)，二溝黃芪smt1基因能夠高效甲基化硒代半胱氨酸，可能是由一個丙氨酸到蘇氨酸的點(diǎn)突變所致[8]。Ellis等[5]首次通過花粉滴管法將smt1基因成功轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株中硒含量可提高近8倍，并能合成甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine)，該氨基酸是野生型擬南芥植株不能合成的。這表明利用smt1基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)富硒植株，并使其具備合成甲基硒代半胱氨酸能力是可行的。Ari等[9]以二溝黃芪smt基因的保守序列為模板，設(shè)計(jì)引物，成功地從A.chrysochlorus中克隆出編碼硒半胱氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶基因。

盛慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，6株P(guān)CR檢測陽性植株進(jìn)行基因表達(dá)檢測時，有2株呈陽性，陽性率為33%。 本研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，在5個PCR檢測陽性植株中有2個植株檢測到陽性表達(dá)，陽性率為40%。其原因可能是部分植株轉(zhuǎn)化后，由于插入位點(diǎn)或插入位置的差異，引起了基因沉默。王鳴剛等[11]利用農(nóng)桿菌EHA105將擬南芥螯合肽合成酶基因(AtPCS1)轉(zhuǎn)入甘農(nóng)1號紫花苜蓿，利用PCR隨機(jī)檢測9株轉(zhuǎn)化株中，6株為陽性，陽性率為67%。此外，在利用同一轉(zhuǎn)化體系將口蹄疫病毒抗原決定融合基因轉(zhuǎn)入時，陽性檢測率僅為57.1%[12]。這表明轉(zhuǎn)化效率可能與轉(zhuǎn)入基因片段有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過雙酶切，將人工合成的富硒基因smt1的cDNA片段連接到工程質(zhì)粒pCAMBIA1301中，成功地構(gòu)建了植物表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌，將目的基因轉(zhuǎn)入苜蓿外植體，并通過組培再生體系，成功獲得轉(zhuǎn)基因單株。通過PCR和RT-PCR檢測，初步驗(yàn)證smt1基因已成功導(dǎo)入苜?；蚪M且能夠正常表達(dá)，為下一步深入開展轉(zhuǎn)基因植株表型性狀鑒定及功能研究奠定基礎(chǔ)。

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