楊星星，謝紅旗，李清明，曾建國,2,3*，熊興耀,2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用國家重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南省中藥提取工程研究中心，湖南 長沙 410331）

葡萄（Vitis viniferaL.）的根、莖、葉、果實均可入藥，具有補氣血、利小便、解毒、消腫等功效[1]。Sierra等[2]發(fā)現(xiàn)葡萄枝條中含有反式白藜蘆醇（trans–resveratrol）和葡萄素。楊敬芝等[3]從刺葡萄地上部分分離得到白藜蘆醇等7個芪化物。白藜蘆醇（3,4’,5–三羥基二苯乙烯）是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管疾病等作用[4]。目前國內(nèi)多采取正交設(shè)計或均勻設(shè)計法優(yōu)化植物中有效成分的提取工藝。這兩種方法均采用線性數(shù)學(xué)模型，精度不高。星點設(shè)計（central composite design，CCD）是在析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，于中心點進(jìn)行的重復(fù)性試驗可提高試驗精度，預(yù)測值更接近于真實值，并且具有試驗次數(shù)較少、可采用直觀三維效應(yīng)面進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與擬合等優(yōu)點，已在藥物提取和處方工藝的優(yōu)化中應(yīng)用[5–10]。本試驗中以葡萄栽種過程中廢棄的葡萄枝蔓為原料，以白藜蘆醇得率為指標(biāo)，運用星點設(shè)計–效應(yīng)面法優(yōu)化白藜蘆醇的提取工藝條件，旨在為白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

葡萄枝蔓樣品由湖南省中藥提取工程研究中心提供。白藜蘆醇對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號為111535–200502，純度≥98%）。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

甲醇、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純，所有試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：Waters 1525 型高效液相色譜儀，Waters 2998工作站（美國沃特世公司）；Mettler ML204電子天平（梅特勒–托利多儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制造機械有限公司）；KQ–5200DB臺式數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 樣品溶液中白藜蘆醇得率的確定

1.3.1 對照品溶液和樣品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取白藜蘆醇對照品10.5 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解，稀釋到刻度，搖勻。

樣品溶液的制備：將葡萄枝蔓粉碎后，過孔徑（850±29） μm篩，精密稱取葡萄枝蔓粉碎樣5.0 g，用乙醇回流提取法提取，將提取液冷卻至室溫后5 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾，得供試品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。按色譜條件進(jìn)樣檢測。色譜條件為：色譜柱為Hypersil，BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇和1%乙酸水，梯度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長310 nm。以對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），以白藜蘆醇色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗和重復(fù)性試驗

精密度試驗：取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按1.3.2中色譜條件進(jìn)行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，在溶液配制后0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣5 μL，按1.3.2中色譜條件進(jìn)行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

重復(fù)性試驗：取同一批供試品6份，按1.3.2中色譜條件進(jìn)行測定，記錄高效液相色譜圖中白藜蘆醇的峰面積。根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.4 加樣回收率測定

精密稱取6份葡萄枝蔓粉碎樣，每份3.0 g，分別加入白藜蘆醇對照品5.0 mg，按樣品溶液制備方法制備，按 1.3.2中色譜條件進(jìn)行測定。計算白藜蘆醇的回收率及回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 白藜蘆醇含量的測定

精密吸取抽濾后的提取液5 μL，按1.3.2中色譜條件進(jìn)行測定，每個樣品進(jìn)樣3次，得樣品中白藜蘆醇含量。

根據(jù)樣品溶液中白藜蘆醇含量計算白藜蘆醇得率。白藜蘆醇得率=提取液白藜蘆醇質(zhì)量濃度（mg/mL）×提取液體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）。

1.4 提取工藝的優(yōu)化

采用星點設(shè)計–效應(yīng)面法優(yōu)化葡萄枝蔓中白藜蘆醇的提取工藝。提取因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和溶媒比、提取次數(shù)。因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不能進(jìn)行回歸處理，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果和工業(yè)生產(chǎn)實際，暫固定為2次。預(yù)試驗中乙醇體積分?jǐn)?shù)（x1）、提取時間（x2）和溶媒比（x3）的值分別為65%～95%、50～150 min、5～15。按試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求[5]確定星點設(shè)計的因素與水平（表1）。

表1 星點設(shè)計的因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

以白藜蘆醇得率（y）對乙醇體積分?jǐn)?shù)（x1）、提取時間（x2）和溶媒比（x3）進(jìn)行線性回歸和二次方程擬合。對擬合出的較適合的模型進(jìn)行方差分析[5]。依據(jù)模型方程繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線。因變量曲面圖是三維圖，只能表達(dá)含兩個自變量的函數(shù)，所以，將3個自變量中的一個固定為中值，分別以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖，利用該圖對影響白藜蘆醇得率的任意2種條件的交互作用進(jìn)行分析和評價。通過等高線的形狀判斷交互作用的強弱：橢圓形表示兩因素交互作用顯著；圓形表示兩因素交互作用不強[10]。

圖1 對照品與樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standard and the sample

1.5 優(yōu)化結(jié)果驗證

精確稱取5.0 g葡萄枝蔓粉碎樣3份，按照試驗所得優(yōu)化提取條件進(jìn)行提取。將提取液離心15 min后過0.45 μm微孔濾膜，測定白藜蘆醇含量，進(jìn)而計算出白藜蘆醇得率。將結(jié)果與擬合方程預(yù)測值進(jìn)行比較，計算實測值與預(yù)測值的偏差。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Design–Expert 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇含量檢測方法的評價

以甲醇和1%乙酸水為流動相，高效液相色譜圖基線穩(wěn)定，樣品中組分分離度好，在此色譜條件下，葡萄枝蔓提取液中白藜蘆醇保留效果較好，基本達(dá)到基線分離（圖1）。

白藜蘆醇質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 43 217x– 527，r=0.999 5。結(jié)果表明：白藜蘆醇質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗結(jié)果：白藜蘆醇峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.4%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果：白藜蘆醇峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.9%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗結(jié)果：白藜蘆醇峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.7%，表明該方法的重復(fù)性良好。

白藜蘆醇回收率為100.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.7%。

2.2 提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 星點設(shè)計試驗結(jié)果

星點設(shè)計的試驗結(jié)果見表2。

表2 星點設(shè)計試驗結(jié)果Table 2 Results of central composite design

2.2.2 模型方程

所得白藜蘆醇得率的線性回歸方程為：y=0.377 31+0.015 26x1–0.000 517x2+0.002 959x3（r= 0.549 7，P＜0.01）。

盡管模型通過檢驗，但擬合度不佳，預(yù)測性較差，因此線性模型不合適。

表3中二次方程的顯著性檢驗結(jié)果表明：一次項乙醇體積分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇得率線性效應(yīng)的影響顯著，料液比對白藜蘆醇得率線性效應(yīng)的影響不顯著；二次項中除料液比外的其他兩因素對白藜蘆醇得率曲面效應(yīng)的影響均顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間的交互作用極顯著。綜上可知，二次方程的r值高于線性方程的，P＜0.01，表明二次方程具有高度顯著性，說明模型與試驗實際擬合良好，試驗誤差小，應(yīng)用效應(yīng)面法優(yōu)化葡萄枝蔓中白藜蘆醇的提取工藝是可行的。

表3 擬合二次方程的方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of quadratic model

2.2.3 提取條件優(yōu)化結(jié)果

由圖2～4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間、溶媒比的交互作用均顯著；溶媒比與提取時間的交互作用不顯著。從圖2～4中等高線圖可以看出各因素的極值應(yīng)在圓心處，初步估計乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶媒比極值的取值范圍為80%～95%、115～135 min、8～11。通過Design–Expert 8 軟件分析，得出回歸模型的最大值點，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90.2%，提取時間129.5 min，溶媒比8.8，在此條件下，白藜蘆醇得率為1.75 mg/g，因此，將乙醇體積分?jǐn)?shù)90.2%、提取時間129.5 min、溶媒比為8.8，回流提取2次確定為較優(yōu)提取工藝。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間條件下的白藜蘆醇得率Fig.2 Resveratrol yield rate under different ethanol concentrations and extraction time

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)與溶媒比條件下的白藜蘆醇得率Fig.3 Resveratrol yield rate under different ethanol concentrations and solvent ratios

圖4 不同溶媒比與提取時間條件下的白藜蘆醇得率Fig.4 Resveratrol yield rate under different solvent ratios and extraction time

2.3 優(yōu)化結(jié)果的驗證

驗證試驗的結(jié)果表明：白藜蘆醇的平均得率為1.73 mg/g。驗證結(jié)果與擬合方程預(yù)測值的偏差為1.14%。偏差較小，可見，由數(shù)學(xué)模型所得到的較優(yōu)條件與設(shè)計目標(biāo)相符，試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，用乙醇回流提取法從葡萄枝蔓中提取白藜蘆醇，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間對白藜蘆醇得率的影響顯著。通過回歸分析和驗證試驗，得到較優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90.2%，提取時間129.5 min，溶媒比為8.8，回流提取2次。在此條件下，葡萄枝蔓中白藜蘆醇的得率為1.73 mg/g。該得率不僅比預(yù)試驗中最佳得率1.69 mg/g的提取效果高出2.37%，且提取成本降低。經(jīng)方差分析，以提取乙醇體積分?jǐn)?shù)（x1）、回流時間（x2）和溶媒比（x3）為自變量，以白藜蘆醇得率（y）為因變量擬合的二次方程模型有效，對試驗結(jié)果擬合較好，有一定應(yīng)用價值。

在本試驗的基礎(chǔ)上還可考察不同提取方法對白藜蘆醇得率的影響，以優(yōu)化提取效果。

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