徐婧 韓迪 許宏連 李燕 指導(dǎo) 楊質(zhì)秀

（黑龍江省中醫(yī)研究院 ·哈爾濱 150001）

平喘顆粒劑對(duì)哮喘豚鼠氣道炎癥及重塑的影響

徐婧 韓迪 許宏連 李燕 指導(dǎo) 楊質(zhì)秀

（黑龍江省中醫(yī)研究院 ·哈爾濱 150001）

目的：觀察平喘顆粒對(duì)哮喘豚鼠氣道炎癥和重塑的影響。方法：將60豚鼠（雌雄兼用）隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥（醋酸潑尼松）組和平喘顆粒高、低劑量組。除空白組外，其余4組用超聲霧化器射1%磷酸組胺、0.2%氯化乙酰膽堿的等量混合液復(fù)制豚鼠哮喘模型。取肺組織進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察豚鼠肺組織病理學(xué)變化，并進(jìn)行免疫組化染色，觀察豚鼠肺組織NF-KB、a-SMA表達(dá)的變化。結(jié)果：平喘顆粒組和陽(yáng)性對(duì)照藥組NF-KB、a-SMA的表達(dá)較模型組明顯降低（P<0.05）;而平喘顆粒各劑量組有不同程度的降低，以高劑量組最為明顯;平喘顆粒各劑量組較陽(yáng)性藥對(duì)照組有所降低（P<0.05）。結(jié)論：平喘顆?？梢杂行У匾种茖?shí)驗(yàn)性哮喘豚鼠氣道炎癥和重塑。

平喘顆粒 哮喘 NF-KB;a-SMA HE染色 免疫組織化學(xué)

支氣管哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)引起，以呼吸道高反應(yīng)性為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。早期病變以小氣道炎癥為主，長(zhǎng)期氣道炎癥導(dǎo)致氣道重塑是支氣管哮喘的嚴(yán)重后果?？刂茪獾姥装Y和防治氣道重塑是是哮喘防治的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察平喘顆粒對(duì)哮喘豚鼠氣道炎癥及重塑的影響，以明確其對(duì)支氣管哮喘的治療作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

試驗(yàn)用豚鼠60只，雌雄兼用，體重150～200g。由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品與試劑

平喘顆粒劑由麻黃、射干、白果、萊菔子、地龍等組成經(jīng)粉碎過(guò)200目篩，水溶制成。磷酸組胺，惠世生化試劑有限公司，上海，批號(hào)：070308。氯化乙酰膽堿，上海三愛思試劑有限公司，批號(hào)：40061130。醋酸潑尼松片，天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20040205。兔抗人NF-KB免疫組化多克隆抗體，批號(hào)：100622531A，福州邁新生物技術(shù)有限公司。鼠抗人a-SMA單克隆抗體，批號(hào)：100505403B，福州邁新生物技術(shù)有限公司。即用快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔LgG聚合物試劑盒，批號(hào)：1005054007D，福州邁新生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 哮喘豚鼠模型的制備及分組

造模參照文獻(xiàn)[1]并稍作修改。操作具體如下∶試驗(yàn)用豚鼠60只，雌雄兼用，體重150-200g。隨機(jī)分為空白組12只，哮喘組48只，然后將哮喘組放入密閉的玻璃鐘罩內(nèi)，用超聲霧化器噴射1%磷酸組胺、0.2%氯化乙酰膽堿的等量混合液15-20s，噴霧停止后觀察6min內(nèi)豚鼠出現(xiàn)抽搐跌倒的時(shí)間，并記錄從噴霧開始到抽搐，跌倒的時(shí)間，稱引喘潛伏期。若引喘潛伏期大于120s者作為不敏感而落選。挑選合格者按體重隨機(jī)分為四組：模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥組、平喘顆粒高劑量組和平喘顆粒低劑量組。次日對(duì)哮喘豚鼠灌胃給藥（1）平喘顆粒劑組：按2g/kg.d,8g/kg.d灌胃，（2）醋酸潑尼松組：按0.00073g/kg.d灌胃，（3）模型組：給予生理鹽水灌胃，再霧化引喘，每周一次，每次5min，連續(xù)4周?？瞻捉M采用生理鹽水進(jìn)行霧化吸入。各組豚鼠在最后一天霧化吸入后處死，取肺組織進(jìn)行免疫組化分析。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

NF-KB、a-SMA測(cè)定 采用免疫組化法，按即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒提供的方法操作。結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)，每張切片在高倍視野（x400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞中陽(yáng)性顆粒的平均光密度值（A值）,A值越大陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 NF-KB、a-SMA免疫組化測(cè)定結(jié)果

NF-KB、a-SMA在模型組、平喘顆粒組及陽(yáng)性藥對(duì)照組均有表達(dá)，空白組弱陽(yáng)性表達(dá)，各組與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組NF-KB、a-SMA的表達(dá)較平喘顆粒組及陽(yáng)性藥對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P＜0.01），平喘顆粒高劑量組NF-KB、a-SMA的表達(dá)較陽(yáng)性對(duì)照藥組降低（P＜0.05），而平喘顆粒低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）見表1。

3.2 肺組織病理學(xué)觀察

HE染色顯示：空白組豚鼠支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常；模型組氣道上皮壞死脫落，氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增厚，粘膜下及管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，氣道壁增厚，官腔狹窄，有時(shí)可見黏液栓堵塞；平喘顆粒組及醋酸潑尼松組較模型組明顯減輕，但平喘顆粒低劑量組與醋酸潑尼松組無(wú)明顯差別，高劑量組較其減輕。

表1 各組豚鼠肺組織NF-KB、a-SMA測(cè)定結(jié)果的比較（A值，±s,n=12）

表1 各組豚鼠肺組織NF-KB、a-SMA測(cè)定結(jié)果的比較（A值，±s,n=12）

注：NF-KB、a-SMA,與空白組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;平喘顆粒高劑量組與醋酸潑尼松組比較，ΔP＜0.05；

組別 NF-KB a-SMA空白組 0.17±0.02 0.22±0.03模型組 0.34±0.06* 0.63±0.07*平喘顆粒中組 0.28±0.03*# 0.45±0.08*#平喘顆粒高組 0.24±0.06*#Δ 0.37±0.05*#Δ醋酸潑尼松組 0.31±0.07*# 0.49±0.07*#

4 討論

既往哮喘的研究過(guò)多地關(guān)注哮喘炎癥反應(yīng)的控制，由于哮喘發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，所以炎癥的控制也異常困難，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在這方面的研究已經(jīng)多年沒有突破性進(jìn)展。從近幾年中醫(yī)藥治療哮喘的研究文獻(xiàn)中可以看出，中醫(yī)藥具有不良反應(yīng)小，不產(chǎn)生耐藥性和依賴性，臨床療效肯定等優(yōu)點(diǎn)。所以，利用祖國(guó)醫(yī)學(xué)的辨證論治，尋求有效的治療有十分重要的意義。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，支氣管哮喘屬于哮癥范疇，楊質(zhì)秀教授根據(jù)支氣管哮喘的病因病機(jī)及發(fā)病的特點(diǎn)，繼承前人又經(jīng)二十年的臨床經(jīng)驗(yàn)，最終研制出平喘顆粒這一治療支氣管哮喘的制劑。本方證乃因感受風(fēng)寒之邪，觸動(dòng)宿痰伏飲，痰隨氣升，氣因痰阻，相互搏結(jié)，壅塞氣道，肺失宣降，而致痰鳴如吼，氣息喘促。治當(dāng)宣肺化痰，降逆平喘。平喘顆粒劑的藥物有射干、麻黃、白果、厚樸等中藥組成。

近來(lái)研究表明，參與哮喘氣道炎癥過(guò)程的細(xì)胞因子、炎癥遞質(zhì)在基因轉(zhuǎn)綠水平上均受NF-KB調(diào)控[2,3]。Barnes[4]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及粘膜下細(xì)胞NF-KB活性增高，提出通過(guò)影響NF-KB的活化可能是治療哮喘的一個(gè)心策略。長(zhǎng)期的氣道炎癥導(dǎo)致氣道重塑，氣道重塑作為慢性哮喘的核心病理改變，是影響慢性哮喘患者生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力的重要因素。氣道平滑肌是起到重塑過(guò)程中的核心的病理改變。而氣道a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）作為平滑肌的特征性標(biāo)記物[6]，所以有效控制a-SMA，對(duì)預(yù)防氣道重塑有重大意義。a-SMA的合成受NF-KB的調(diào)控，所以，抑制NF-KB的活化顯得更加重要。本實(shí)驗(yàn)以超聲霧化器射1%磷酸組胺、0.2%氯化乙酰膽堿的等量混合液復(fù)制豚鼠哮喘模型，來(lái)觀察平喘顆粒在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)NF-KB、a-SMA表達(dá)的影響，來(lái)明確中藥對(duì)哮喘的防治作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組氣道上皮壞死脫落，氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增厚，粘膜下及管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，氣道壁增厚，官腔狹窄，有時(shí)可見黏液栓堵塞；平喘顆粒組較模型組明顯減輕。平喘顆粒組的NF-KB、a-SMA的表達(dá)明顯降低，能夠起到控制哮喘的作用。

［1］李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[S].第二版。

［2］Cromwell O,Hamid Q,Corrigan CJ,et al. Expression and qeneration of interleukin-8,IL-6 and granuloytc-macrophage colcny-stimulsting factor by bronchial epithelial cells and enhanceuent by IL-1 beta and tunour necrosis factor-alphl[J]。Immunology,1992,77(3)∶330-337.

［3］Blackwell TS, Christmall JW.The role of neclear factorkappa B ineytokine gene regulation[J].Am J Respir cell Mol Biol,1997,17(1)∶3-9.

［4］Barnes PJ,Adcock IM. NF-kappa B∶ aprvotal role in asthma and a new targt for therapy[J] .Trends pharmacol Sci,1997,18(2)∶46-50.

［5］Shama RA, Gescher AJ,Steward WP.Curcum in the story so far[J].Eur J Cancer,2005,41(13)∶195-196.

［6］Schmid M, Sun G,Stacey MA,et al. Identification of Circulsting fibrocytes as precursors of bronchial myofibrolasts in asthma[J]. J Immunol,2003,171(1)∶380-389.

（2012-04-16 收稿）