王 鶴， 朱杰華， 楊志輝， 韓彥卿， 王 宇， 徐小虎

（河北農業(yè)大學植物保護學院，保定 071000）

從1845年馬鈴薯晚疫病在愛爾蘭暴發(fā)至今，晚疫病一直受到世界植物病理學家的矚目，盡管世界各國均投入了無以計數的人力和財力進行研究，但至今為止馬鈴薯晚疫?。╬otato late blight）仍然是馬鈴薯生產上最具毀滅性的病害。究其原因，應該說致病疫霉病菌群體結構的變化是導致晚疫病防不勝防的主要原因之一。

致病疫霉群體結構的變化可以通過測定表現型（交配型、甲霜靈抗性和生理小種）和基因型結構來分析和衡量。20世紀80年代以后，隨著致病疫霉“新”群體在世界范圍內的擴散，致使致病疫霉群體結構的組成與變化日趨復雜［1］。自1996年Zhang等［2］首次報道我國發(fā)現A2交配型以來，伴隨致病疫霉甲霜靈抗性群體的發(fā)生，由于A2交配型菌株與已有的A1交配型菌株可進行有性生殖，導致寄生適合度更高的后代菌株產生，從而愈發(fā)加快了我國致病疫霉群體表型的變異［3］。劉曉鵬等［4］、姚裕琪等［5］、楊艷麗等［6］在20世紀90年代中期對我國致病疫霉生理小種測定結果顯示，小種組成相對簡單，包含毒力基因數目較少。之后，朱杰華等［7］、楊艷麗等［8］對我國各地分離的致病疫霉生理小種測定結果顯示小種組成明顯復雜。近幾年，趙志堅等［9］、韓彥卿等［10］均報道了致病疫霉“超級生理小種”（能克服所有已知的R1～R11等11個抗病基因）的發(fā)現。加之高比例的甲霜靈高抗群體在我國各地陸續(xù)報道［11－12］，以上表明我國致病疫霉群體組成愈加復雜，給我國的晚疫病防治帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，因此針對不同地區(qū)致病疫霉的群體表型的變化，及時的跟蹤報道就顯得至關重要。

2009年黑龍江和吉林省馬鈴薯晚疫病再次暴發(fā)［13］，該病的嚴重發(fā)生是否與病菌群體建構新特征有直接關系值得探討和關注，因此本研究對2009年采自我國黑龍江和吉林兩省部分馬鈴薯主產區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌進行交配型、甲霜靈敏感性及生理小種測定，從交配型、甲霜靈敏感性和生理小種毒力基因的組成與變化等方面來分析晚疫病菌的群體結構特征，從而進一步分析2009年黑龍江和吉林馬鈴薯晚疫病的發(fā)生與流行規(guī)律，為全面指導我國各馬鈴薯主產區(qū)的晚疫病防治奠定理論基礎。

1 材料和方法

1．1 供試菌株

供試馬鈴薯致病疫霉菌株110株，其中108株于2009年8月采自我國黑龍江（50株）和吉林（58株）；交配型測定標準菌株28（A2交配型）和96（A1交配型），由瑞士 Biological Research Center，Syngenta公司惠贈。

1．2 供試培養(yǎng)基及藥劑

黑麥培養(yǎng)基：黑麥60 g，瓊脂粉12 g，蔗糖20 g，補充蒸餾水定容至1 000 mL。96．5%甲霜靈原藥由先正達中國投資有限公司提供。

1．3 鑒別寄主

供試鑒別寄主由CIP駐京辦通過國際馬鈴薯中心引進，由11個含有R1～R11主效抗病基因的抗病品種和1個不含抗病基因的感病品種（r）組成。鑒別寄主培育參照朱杰華等［14］的方法。

1．4 交配型測定

交配型測定采用對峙培養(yǎng)法將被測菌株的菌盤（5 mm×5 mm）放在培養(yǎng)皿中，分別與已知的A1（96）標準菌株和 A2（28）標準菌株的菌盤（5 mm×5 mm）間隔2 c m培養(yǎng)。在18℃生化培養(yǎng)箱內黑暗培養(yǎng)10～15 d。用顯微鏡檢查兩菌落交界處是否有卵孢子出現。當檢查發(fā)現與A2菌株配對的待測菌株之間有卵孢子產生時，待檢測菌株即為A1型，相反，如果待測菌株與A1配對產生了卵孢子，則待測菌株為A2型。如果與兩個標準菌株均有卵孢子產生，且自身也能產生卵孢子為自育型。

1．5 甲霜靈敏感性測定

甲霜靈抗性測定采用菌落直徑法進行，抗性標準劃分參照Daggett等［15］的方法，根據含藥平板菌落直徑與空白對照平板菌株直徑的比值對待測菌株的甲霜靈敏感性標準進行劃分。具體劃分標準如下：dck為CK菌落直徑；d5為含藥5 mg／L培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌的菌落直徑；d100為含藥100 mg／L培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌的菌落直徑。敏感：d5／dck≤0．4；中抗：d100／dck≤0．4＜d5／dck；高抗：d100／dck＞0．4。

1．6 生理小種測定

晚疫病菌生理小種測定參照朱杰華等［14］的方法，在室內采用離體葉片法進行測定。按Black等［16］確定的馬鈴薯晚疫病菌生理小種統(tǒng)一國際命名系統(tǒng)對被測菌株的小種進行命名。

2 結果與分析

2．1 被測菌株的交配型及其對甲霜靈的敏感性

通過測定發(fā)現，2009年采自黑龍江、吉林的94株晚疫病菌均為A1交配型菌株，未發(fā)現A2交配型菌株及自育菌株。甲霜靈敏感性測定結果表明，被測的46株黑龍江省致病疫霉菌株中，23株為抗性菌株，23株為敏感菌株，甲霜靈抗性和敏感菌株各占被測菌株的50%；采自吉林的48個致病疫霉菌株中，甲霜靈抗性、敏感菌株分別為34株、14株，分別占被測菌株的70．8%、29．2%。黑龍江和吉林均未發(fā)現中抗菌株。兩省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性詳細對比見表1。

表1 2009年黑龍江和吉林省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性差異

2．2 生理小種測定

對黑龍江（33株）和吉林（49株）致病疫霉菌株進行了生理小種測定，其中在黑龍江發(fā)現24個生理小種，在吉林發(fā)現19個生理小種，共鑒定出34個生理小種（表2），其中9個生理小種兩省普遍存在，此外在被測菌株中還發(fā)現了18個菌株，含有能克服所有已知的R1～R11 11個抗病基因的“超級毒力小種”，占所有被測菌株的22%。本研究未發(fā)現0號小種，其中含有5個以上毒力因子的菌株有77株，約占被測菌株的93．9%，平均每個菌株含有8．42個毒力因子（黑龍江7．48，吉林9．06）。在被測致病疫霉菌株群體中發(fā)現了所有與已知11個主效抗病基因相對應的vir1～vir11 11個毒力基因，但所測菌株的毒力基因出現頻率存在差異（圖1），在黑龍江vir1出現頻率為18．2%，vir2和vir8的出現頻率約為30%；在吉林vir8出現頻率最低，為44．9%，其余毒力基因頻率均大于50%，毒力基因出現頻率普遍較高，但在榆樹vir1的頻率為33．3%。

表2 2009年黑龍江和吉林晚疫病菌生理小種測定結果

圖1 黑龍江和吉林省致病疫霉的毒力基因發(fā)生頻率

3 討論

本研究所發(fā)現的我國黑龍江和吉林兩省致病疫霉群體交配型結構比較單一，均為A1交配型。表明黑龍江省仍然未有A2型菌株的入侵，因此要加強檢驗檢疫工作，嚴把種薯質量關，尤其是來源于A2交配型發(fā)生區(qū)的種薯要加強監(jiān)測；其次做好預測預報工作，監(jiān)測馬鈴薯晚疫病發(fā)生動態(tài)，及時防治。以防為主，綜合治理，嚴防其傳入該地。李本金等［17］在對1998年－2007年采自我國各地致病疫霉的群體結構研究中，報道過吉林省致病疫霉A2交配型的存在，筆者未有發(fā)現，這種現象的發(fā)生并非偶然，從1996年A2交配型在我國首次發(fā)現，之后我國陸續(xù)報道了 A2交配型的發(fā)生及擴大［18－19］，但隨后卻出現了A2交配型比例急劇下降甚至消失的情況［11，20］，歐洲多數國家也出現過這樣的現象［21］，這種現象發(fā)生的原因尚不明確。馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈高抗菌株在我國東北已普遍存在，致病疫霉抗性群體的比例不斷加大，導致晚疫病田間防治愈加困難。但不同地區(qū)抗／感比例存在明顯差異，如吉林省敦化市致病疫霉均為高抗，而吉林省榆樹市則均為敏感。針對致病疫霉對甲霜靈敏感的地區(qū)，甲霜靈仍可繼續(xù)使用，但是一定要輪換用藥，以防抗性菌株的產生，延長甲霜靈類藥劑的使用年限。2003年金光輝等［22］報道黑龍江省致病疫霉生理小種組成多為單毒力基因，最多不超過4個毒力基因組合，而本研究結果顯示我國東北致病疫霉生理小種的組成日趨復雜，平均毒力因子超過8個，且被測82個菌株中約20%為“超級毒力小種”。究其原因除了與含有主效抗病基因的馬鈴薯品種的大力推廣，對晚疫病菌造成選擇壓力，導致突變產生新的毒力基因所致以外，種薯調運將毒力基因復雜的病原菌傳入該地，也是導致生理小種日趨復雜的重要原因。

雖然在被測致病疫霉菌株中發(fā)現了與馬鈴薯已知11個主效抗病基因相對應的vir1～vir11等11個毒力基因，但在黑龍江部分地區(qū)含有R1、R2和R8的抗病品種還能起到抗病作用；在吉林榆樹致病疫霉菌株中含vir1的頻率為33．3%，表明含有R1的抗病品種在該地區(qū)還能起到一定抗病作用。這就為我國抗晚疫病育種策略以及抗病品種在該地合理布局提供了指導，一方面加大力度發(fā)掘新的垂直抗病基因，另一方面盡量從現有品種中篩選抗病品種，在該地區(qū)生理小種持續(xù)監(jiān)測的基礎上，對含有可利用抗病基因的抗病品種進行合理布局，以延長其使用年限。

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